Альфредия поникшая (Alfredia cernua)

СОДЕРЖАНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Систематическое положение, степень химической изученности и применение в народной медицине растений рода альфредия
1.2. Характеристика ноотропных лекарственных средств, основные пути поиска новых препаратов синтетического и природного происхождения

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1. Объект исследования
2.2. Методы исследований

Глава 3. Фитохимическая характеристика основных групп биологически активных веществ и элементный состав надземной части альфредии поникшей

Глава 4. Способы получения и идентификация биологически активных веществ фармакологически активного экстракта альфредии поникшей и его фракций

Глава 5. Разработка нормативной документации на лекарственное растительное сырье и жидкий экстракт альфредии поникшей
5.1. Стандартизация травы альфредии поникшей
5.1.1. Определение морфолого-анатомических признаков травы альфредии поникшей
5.1.2. Разработка методик качественного обнаружения и количественного определения флавоноидов в траве альфредии поникшей
5.1.3. Определение динамики накопления флавоноидов в траве альфредии поникшей
5.1.4. Определение товароведческих показателей травы альфредии поникшей
5.2. Стандартизация жидкого экстракта альфредии поникшей

Выводы
Список литературы
Благодарности
Приложение

Введение

Актуальность темы. В структуре современного фармацевтического рынка неуклонно растет доля средств, разработанных на основе лекарственного растительного сырья. По данным Всемирной организации здравоохранения, около 80 % населения используют фитопрепараты для лечения и профилактики различных заболеваний. Широкий спектр их действия объясняется многокомпонентностью химического состава и мягким комплексным воздействием на организм (Лекарственные растения ..., 2008; Theodoratou, 2007; Tin, 2007; Wang, 2007; Fang, 2008; Mariani, 2008; Tiwari, 2008; Yimin, 2008).

Ограниченный ассортимент ноотропных лекарственных средств синтетического происхождения, вызываемые ими побочные эффекты и широкое распространение невротических расстройств, диктует необходимость создания фитопрепаратов ноотропного действия из растений флоры России.

Альфредия поникшая (сем. Asteraceae) - многолетнее травянистое растение, произрастающее на территории Кузнецкого Алатау, Республики Горный Алтай и Алтайского края. Данное растение успешно культивируется на экспериментальной базе Сибирского ботанического сада Томского государственного университета. В народной медицине надземную часть альфредии используют в качестве противосудорожного и болеутоляющего средства, в сборах - при энурезе, неврастении, шизофрении.
Учитывая широкое применение растения народами Сибири при неврологических патологиях и малую степень его изученности, определены выбор объекта и цель наших исследований.

Цель работы.
Фармакогностическая характеристика надземной части альфредии поникшей и разработка на ее основе экстракта, обладающего ноотропной активностью.
Для достижения поставленной цели исследования необходимо было решить следующие задачи:
1) определить основные группы биологически активных веществ надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей;
2) разработать рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей, изучив влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ;
3) изучить химический состав фармакологически активного экстракта и его фракций, установить строение выделенных индивидуальных соединений;
4) определить морфолого-анатомические диагностические признаки травы и разработать методики анализа для оценки критериев подлинности и количественного содержания действующих веществ в траве и жидком экстракте;
5) разработать нормативную документацию на лекарственное растительное сырье и жидкий экстракт альфредии поникшей.
Научная новизна. Установлены микроскопические диагностические признаки травы альфредии поникшей, заключающиеся в наличии простых многоклеточных тонкостенных и толстостенных, звезчато-лучистых и
двухрядных волосков на эпидермисе листа, цветка и стебля.
Впервые определен химический состав биологически активных веществ, макро- и микроэлементов надземной части альфредии поникшей.
Разработан рациональный способ получения экстракта надземной части растения на этаноле, рекомендуемого в качестве ноотропного средства.
Впервые установлен химический состав фармакологически активного экстракта альфредии поникшей, выделены из активного экстракта флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), сумма тритерпеновых спиртов (а- и р-амирин, моретенол, лупеол), лигнан (арктиин) и органические кислоты (коричная, ванилиновая, хлорогеновая).
Разработаны методики качественного обнаружения хроматографией в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии флавоноидов (изокверцитрин), положенные в основу стандартизации травы и жидкого экстракта альфредии поникшей.

Практическая значимость. На основании данных фитохимического, фармакологического и товароведческого анализа разработаны проекты ФС «Альфредии поникшей трава» и «Альфредии поникшей экстракт жидкий».
Разработаны методики определения подлинности и количественного содержания действующих веществ в траве и жидком экстракте альфредии поникшей.

Полученные результаты внедрены в учебный процесс кафедры биологической химии с курсами медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, кафедры биологии с экологией и курсом
фармакогнозии Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого, кафедры фармации Омской государственной медицинской академии, кафедры геоэкологии и геохимии
Национального исследовательского Томского политехнического университета.

Положения, выносимые на защиту:
1. Химический состав надземной части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей представлен простыми
фенолами, флавоноидами, кумаринами, органическими кислотами, лигнанами, стеринами, тритерпеновыми соединениями,
каротиноидами, полисахаридами, аминокислотами, макро- и микроэлементами.

2. Рациональный способ получения экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле, из которого выделены лигнаны (арктиин),
флавоноиды (кверцетин, изокверцитрин, рутин), органические кислоты (коричная, ванилиновая и хлорогеновая) и тритерпеновые
спирты (а-амирин, Р-амирин, моретенол, лупеол).

3. Микроскопические диагностические признаки сырья альфредии поникшей, заключаются в наличии различных типов волосков на эпидермисе листа, стебля и цветка.
4. Методики качественного обнаружения флавоноидов (изокверцитрина) в траве и жидком экстракте растения методом
хроматографии в тонком слое силикагеля и количественного определения методом дифференциальной спектрофотометрии по
реакции с алюминия хлоридом в видимой области спектра.
Апробация работы и публикации: Основные положения работы доложены и обсуждены на IV Всероссийской научной конференции «Химия и
технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения
профессора Л.Н. Березнеговской (Томск, 2006), III и IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии
растительного сырья» (Барнаул, 2007, 2009), VIII Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2007), VI Всероссийском
научном семинаре с молодежной научной школой «Химия и медицина» (Уфа, 2007), II Международной научной конференции «Химия, технология и
медицинские аспекты природных соединений» (Алматы, Казахстан, 2007), V Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность»
(Москва, 2008), ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009), конференции «Разработка, исследование и
маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2009).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 18 научных работах, из них 4 - в периодических изданиях, рекомендованных
ВАК МО и науки РФ, 3 патента РФ на изобретение.

Глава 1. Обзор литературы
1.1. Систематическое положение, степень химической изученности и применение в народной медицине растений рода альфредия
На территории России и стран СНГ самым распространенным семейством является семейство сложноцветных — Asteraceae, одним из
представителей которого является род альфредия {Alfredia L.). В мире насчитывается пять видов растений этого рода: альфредия поникшая {Alfredia
cernua (L.) Cass.), альфредия снежная {Alfredia nivea Каг. et Юг.), альфредия колючечешуйчагая {Alfredia acantbolepis Каг. et Kir.), альфредия
цельнолистная {Alfredia integrifolia Tuljag.) и альфредия фетиссова {Alfredia fetissowii Iljm.) [51, 52, 102, 104, 135, 136, 141, 142]. В России род альфредия
представлен двумя видами — альфредия поникшая и альфредия снежная [102].
Наиболее близкие к роду-альфредия {Alfredia L.) по морфологическим и географическим характеристикам являются представители рода чертополох
{Cardials L.) и ольгеа {Olgaea Djin). Род Alfredia L. выделен Кассини из линнеевского рода Cnicus. В дальнейшем разные авторы рассматривали
Alfredia L. в различных таксономических единицах. Лессинг [185] признавал его в качестве подрода из-за наличия придатков на листочках обертки в роде
Rhapontician Vaillants'a. Бентам [159] свел его в синонимы рода Carduns.
Принимая это, Гофман [177] возвел Alfredia в ранг секции в роде Carduns.
Ильин в 1922 году описывает близкий к Carduns род Olgaea, и позднее [52] дает монографический обзор родов Alfredia и Olgaea. Однако в своих
исследованиях Ильин (1924) хорошо показал отличия двух последних родов от рода Carduus [111]. Эта же система была принята и во Флоре СССР.
Исследования зарубежных авторов точного ответа на родственные связи и происхождение альфредии не дают [175, 199, 200]. В 1934 г. японские
ботаники — Kitagava и Kitamura описали род Takeikadzuchia, ныне сведенный в синонимы к роду Olgaea. Казми [181, 182] в монографическом обзоре рода
Carduus на основании анатомо-морфологических особенностей строения генеративных и вегетативных органов рода, вновь сводит Alfredia и Olgaea в
синонимы к роду Carduus.

Альфредия поникшая представляет собой многолетнее медоносное травянистое растение высотой 1,5-3 м. Корневище растения укороченное с
многочисленными корневыми мочками. Стебель прямой, паутинисто-шерстистый, бороздчатый, ветвистый в верхней части, внутри полый.
Нижние листья длинночерешковые, сердцевидно-яйцевидные, по краям выемчато-зубчатые с тонкими мелкими шипиками; сверху голые, зеленые,
снизу бело-войлочные; средние листья меньше, черешки короткие, крылатые, стеблеобъемлющие, пластинка более острая; верхние листья сидячие,
стеблеобъемлющие, зубчики с мелкими острыми шипиками. Корзинки 4-5 см диаметром, поникающие на концах стебля и ветвей. Листочки обертки
светло-желтого цвета, узкие, линейные, с короткими темными волосками.
Семянки 6-7 мм дл., серые с коричневыми пятнами [4, 41, 50, 52, 53, 65, 66, 90,92,104,135,136,202].

Кариологический анализ, проведенный для растений, произрастающих в естественной популяции на территории Томской области и для
интродуцентов, культивируемых в Сибирском ботаническом саду Томского государственного университета выявил, что для альфредии поникшей
характерен внутривидовой хромосомный полиморфизм, кроме 2п = 26, известно также число хромосом, равное 24 [4, 62].
Встречается альфредия поникшая в Томской, Новосибирской и Кемеровской областях, а также в Алтайском крае - Барнаульском
флористическом районе и Республике Алтай, в Средней Сибири: в Красноярском крае — Верхнеенисейском флористическом районе и в
Республике Хакасия. Вне Сибири альфредия произрастает в Средней Азии (Джунгаро-Тарбагатайский район) [4,53, 92, 102, 104, 135, 136].
Альфредия поникшая обитает на высокотравных лугах, полянах среди разреженных пихтово-еловых лесов [4, 95, 104, 135, 136]. В Горной Шории
альфредия приурочена к широкотравным ценозам черневой тайги [61, 114].
Растение также встречается в березово-осиновых лесах, зарослях кустарников [4, 102].

Альфредия снежная произрастает в горных степях, еловых лесах, скалах субальпийского и альпийского пояса. На территории Сибири
обнаружена в Центральном Алтае по долине реки Чуй и его правого притока Тутугой[102, 136].
По некоторым литературным данным альфредия поникшая является эндемичным растением, произрастающим на территории Катунского и
Алтайского заповедников, а также входит в состав редких и нуждающихся в охране растительных сообществ Сибири [12, 13, 48, 61, 109]. Другие авторы
указывают на достаточно большие запасы растения [65, 66, 92].
При культивировании альфредии поникшей не возникает трудностей. В Центральном сибирском ботаническом саду СО РАН растение
культивируется с 1969 г., в Сибирском ботаническом саду Томского государственного университета- с 1982 г. Кроме вышеназванных, альфредия
имеется в Центральном ботаническом саду Национальной академии наук Беларуси (ЦБС НАНБ), Главном ботаническом саду им. Н.В. Цищша
Российской Академии Наук, Ботаническом саду Московского Государственного Университета им. М. Ломоносова, Ботаническом саду БИН
РАН им. В.Л. Комарова, Ботаническом саду Тверского государственного университета. Альфредия снежная культивируется в Главном ботаническом
саду им. Н.В. Цицина Российской Академии Наук и Ботаническом саду Московского Государственного Университета им. М. Ломоносова. Альфредия
колючечешуйчатая — в Главном ботаническом саду им. Н. В. Цицина Российской Академии Наук [4, 106].

В народной медицине альфредия поникшая находит достаточно широкое применение. Трава растения обладает противосудорожным
действием, применяется при нервных заболеваниях, не токсична. По сообщению Л. А. Уткина [125], отвар травы (1:10) используют при нервных
заболеваниях, головокружении и эпилепсии. Наружно — в виде примочек и компрессов. Настой из подземной части растения в Восточном Казахстане
используют в качестве тонизирующего средства. Отвар соцветий — при гастралгии, как болеутоляющее, при энурезе. Применяют альфредию
поникшую и в качестве суррогата чая. Кроме того, трава растения входит в состав сборов, применяемых при энурезе, неврастении, шизофрении [37, 41,
65, 66, 90, 104].

По сообщению В. П. Амельченко с соавторами [5], исследование надземной части альфредии поникшей на модели максимального электрошока и «коразолового титрования» показало наличие противосудорожной активности.
По сведениям В. П. Амельченко и соавт. (1995 г.) в надземной части альфредии поникшей предварительно обнаружены алкалоиды, сесквитерпеновые лактоны, дубильные вещества, полифенольные соединения (флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, кумарины) и их гликозиды, эфирные масла [5].

1.2. Характеристика ноотропных лекарственных средств, основные пути поиска новых препаратов синтетического и природного происхождения

В 1972 году в исследовательской лаборатории фирмы UCB (Бельгия), являющейся одной из крупнейших фармацевтических фирм Западной
Европы, Giurgea и сотрудники установили, что под влиянием пирацетама облегчаются процессы обучения, улучшается память. При этом действие
пирацетама не сопровождается побочными эффектами, характерными для психостимулирующих средств: двигательное и речевое возбуждение,
истощение функциональных возможностей организма, привыкание и пристрастие. Результаты этих исследований привели к созданию нового
класса веществ - класса ноотропов [174].

Ноотропы (от "noos" — мышление, разум; "tropos" — стремление, сродство), по определению Giurgea (1982) — это вещества, способные
активировать интегративную деятельность мозга, оказывать стимулирующие влияние на обучение, улучшать память и умственную деятельность, особенно
при их нарушении, а также повышать жизнедеятельность мозга и устойчивость организма к воздействию повреждающих факторов (гипоксия,
интоксикация, травма, стресс и др.) [33, 46, 57].

При этом действие пирацетама не сопровождается побочными эффектами, характерными для психостимулирующих средств:
- двигательное и речевое возбуждение,
- истощение функциональных возможностей организма,
- привыкание и пристрастие.

Результаты этих исследований привели к созданию нового класса веществ - класса ноотропов [Giurgea, C. E. The nootropic concerpt and its prospective implication / C. E. Giurgea // Drug Development Research. - 1982. - Vol. 2. - P. 441-446. 175.Haffher, E. On the phylogeny of the subtribe Carduinae (tribe Cardueae, Compositae) / E. Hafrher. - Englera, 2000. - N 21. - P. 1-209.]

Классификация веществ с ноотропным действием

Современная классификация ноотропных препаратов, предложенная Т. А. Ворониной и С. Б. Середениным (2007), основана на представлениях о механизмах действия веществ и учитывает их химическое строение.

1. Ноотропные препараты — активаторы метаболизма мозга и белково-нуклеинового синтеза

1.1. Производные пирролидона (рацетамы): пнрацетам, дипрацетам, ролзирацетам, оксирацетам, этирацетам, фенотропил, анирацетам, прамирацетам, небрацетам, изацетам, нефирацетам, детирацетам и др.

1.2. Вещества природного происхождения и близкие к ним: церебролизин, аналоги церебролизина№РЕР-12 и Е021, актовегин, церебрал, липоцеребрин, цереброкурин, кортексин, пиритинол, пиявит, пантогематоген, полидан и др.

2. Ноотропные препараты, реализующие действие через нейромедиаторные системы

2.1. Холинэргические вещества,
2.1.1. Вещества, вызывающие усиление синтеза ацетилхолина и его выброса: холин хлорид, фосфотидилсерин, лецитин, ацетил-Ь-карнитин, МКС-231, ююбеттропит, тиоперамин GT-2016, иодопроксифан, UCL-1390, AQ-0145, 2К9346-бетакарболин, линопирдин (DUP 996) и др.
2.1.2. Ингибиторы ацетилхолинстеразы: физостигмин, такрин, галантамин, донепезил, ривастигмин, амиридин, нейромедин, метрифонат, велнакрина малеат, эртастигмин, зифросинол, минаприн, капроктамин, гаперзин А, фенсерин и др.
2.1.3. Агонисты л*-холинергических рецепторов: оксотреморин, бетанехол, ксаномелин, меламелин, сабкомелин, AF102B, цевимелин, алвамелин, УМ-796, AF151, талсаклидин (WAL2014FU), SCH-57790, SCH-72788 и др.
2.1.4. Агонисты w-холинергических рецепторов: АВТ098, АВТ089, АВТ418, ТС1734, МЕМ3453, Sffi-1553A, SSR180711, GTS21, эпибатид, анабазин и др.

2.2. Вещества, влияющие на систему возбуждающих аминокислот: глутаминовая кислота, глицин, нооглютил, Д-циклосерин, мемантин, мелацемид, ампалекс, унифнрам, сунифирам, 4-аминопиперидины, димебон, СР101606,ЫР81506идр.

2.3. Вещества, влияющие на систему ГАМК: гаммалон, пантогам, пикамилон, щжотинамид, фенибут, натрия, лития и кальция оксибутират (нейробутал), габапентин, PCALC36, SB737552, NS105 и др.

2.4. Вещества, влияющие на серотонинергическую систему: антагонист 5НТ6 рецепторов SB742457, частичный агонист 5НТ4 рецепторов SL650155, агонисты 5-НТ1А рецепторов - халипроден, 8-OH-DPAT и др., антагонисты 5-НТЗ рецепторов - ондансетрон и мирисетрон.

2.5. Вещества, влияющие на дофамшергическую систему и ингибиторы МАО: пирибедил, сумаринол, ВР897 и АВТ431, NS2330, лазабемид, селегилин, расагилин и др.

2.6. Вещества, влияющие на аденозиновую систему, фосфодиэстеразу:
кофеин, пропентофиллин, ролипрам, МЕМ1414, НТ0712 и др.
2.7. Вещества, влияющие на гистаминовую систему: А349821 и др.
2.8. Вещества, влияющие на каннабиноидную систему.
3. Нейропептиды и их аналоги: АКТГ 1 - 10 и его фрагменты,
соматостатин, вазопрессин, тиролиберин и их аналоги (NC1900, FK960 и др.),
ангиотензин-Н, субстанция Р, эбирагид, семакс, ноопент, нейропептид Y,
холецистокинин-8, ингибиторы пролилэндопептидазы (JTP-4819, S17092, ЗП-
20, ЗП-22 и др.), беглимин и др.
4. Нснростеронды и мелатоннн: 7-р-эстрадиол, эстрадерм, J811, J861,
дегидроэпиандростерон (DHEA) и его сульфат (DHEAS), карбеноксолон,
мелатонин.
5. Антиокспданты: мексидол, дибунол, фосфотидилсерин, пиритинол,
меклофеноксат, атеровит, эксифон, цитидиццифосфохолин, тирилазад
месилат, а-токоферол, гинкго билоба и др.
6. Антогонисты кальция: нимодипин, циннаризин, флунаризин, ивалдипин и др.
7. Церебральные вазодшттаторы: винкамин, ницерголин,
винпоцетан, винконат, гидергин, виндебунол, нафтидрофурил и др.
8. Вещества, влияющие на протеинкиназы: этимизол, СЕР 1347,
А8601245идр.
9. Витамины и их аналоги, пищевые добавки, вещества
растительного происхождения: витамины Е, В6, В^, фолаты, тиамин,
лецитин (фосфотидилхолин), фосфотидилсерин, а-липоевая кислота, L-
карнитин, ацетил-Ь-карнитин, гинкго билоба, женьшень, лимонник и др.
10. Вещества, влияющие на нейротрофиновую систему: прямые
(фрагменты NGF92 в р-поворотной конформации, сурамин), и непрямые
(аналоги аденозина) активаторы Тгк рецепторов; вещества, влияющие на
экспрессию и секрецию нейротрофинов (неотрофит, семакс, идебенон,
агонисты и позитивные модуляторы АМРА-рецепторов); модуляторы
нейротрофиновой системы (церебролюин, СЕР-1347, NDD-094).
11. Вещества, влияющие на процесс нейродегенерации при болезни
Альцгеймера: вещества, уменьшающие синтез и влияющие на агрегацию,
деагрегацию и депонирование р-амшюида и производящие «очистку»
амилоидных бляшек, хелатирующие металлы, вещества, уменьшающие
гиперфосфорилирование белка тау и блокаду тау-агрегацина, увеличивающие
уровень шаперонов, противовоспалительные средства, статины и др.
12. Средства для лечения синдрома дефицита внимания с
гиперактивностью (СДВГ) у детей и взрослых: метилфенидат,
амфетамины, атомоксетин, модафинил, фенибут, фенотропил и др.
13. Комбинированные препараты: фезам (пирацетам, циннаризин),
винпотропил (пирацетам, винпоцетин), ороцетам (пирацетам, оротовая
кислота), диапирам (пирацетам, диазепам), нейронал (пирацетам, янтарная
кислота, рибоксин, никотинамид, рибофлавин-мононуклеотид, пиридоксин),
инстенон (гексабидин, этамиван, этафиллин), цитофлавин (янтарная кислота,
рибоксин, никотинамид, рибофлавин-мононуклеотид) и др.

14. Вещества из разных групп: оротовая кислота, метилглюкооротат,
фолиевая кислота, ганглиозиды, глюкокортикоиды, геровитал НЗ,
диметиаминоэтанол (ДМАЭ), СДР-холин (цитохолин) и др. [33, 35, 76].
Механизм действия ноотропных средств связан с направленным
влиянием на кору больших полушарий. Они облегчают передачу нервных
импульсов между полушариями головного мозга, усиливают
контролирующее влияние коры на подкорковые структуры и улучшают
функции нейронов. Этот механизм связан с несколькими аспектами. В
частности, ноотропные средства улучшают биоэнергетику головного мозга.
Они увеличивают синтез АТФ и цАМФ, утилизацию глюкозы,
интенсифицируют гликолиз и аэробное дыхание, способствуют росту
активности аденилатциклазы, что улучшает состояние организма, так как при
старении и нервно-психических заболеваниях наблюдается дефицит энергии
и снижение активности аденилатциклазы в нейронах.

Ноотропы, имеющие структуру ГАМК, оказывают
противогипоксический эффект путем влияния на биохимические реакции
ГАМК-шунта. ГАМК-шунт представляет собой обходной путь между
последовательными метаболитами цикла трикарбоновых кислот — а-
кетоглутаровой и янтарной кислотами. Часть а-кетоглутаровой кислоты
превращается в янтарную не непосредственно, а подвергаясь вначале
восстановительному аминированию в глутаминовую кислоту. Затем
глутамнновая кислота декарбоксилнруется в ГАМК. ГАМК вступает в
реакцию переаминирования с а-кетоглутаратом с образованием
глутаминовой кислоты и янтарного полуальдегида. Последний либо
восстанавливается в ГОМК, либо окисляется в янтарную кислоту. Система
ГОМК-янтарный полуальдегид в условиях дефицита кислорода поставляет
дополнительный фонд окисленного НАД*, участвующего в окислении
лактата в пируват. Это уменьшает токсическое действие лактата на
ферментные системы клеток, нормализует азотистый обмен с устранением
свойственного гипоксии накопления аммиака. Корреляция
противогипоксического и мнемотропного действия ноотропов отсутствует.

Ноотропные средства повышают синтез и выделение неиромедиаторов.
Блокируя калиевые каналы, они облегчают деполяризацию мембран, что
влияет на освобождение неиромедиаторов, активируют синтез, освобождение
и оборот дофамина, норадреналина, ацетилхолина, ингибируют МАО,
увеличивают образование р-адренорецепторов, холинорецепторов и
нейрональный захват холина. Ацетилхолин необходим для процессов
запоминания. Серотонин ускоряет обучение и удлиняет сохранение навыков,
если в их основе лежит положительное эмоциональное подкрепление.
Норадреналин ускоряет обучение в случаях использования отрицательного
эмоционального подкрепления [33].

При старении и нервно-психотических заболеваниях уменьшается
активность ферментов синтеза медиаторов, нарушается их нейрональный
захват и связывание с рецепторами. В частности, снижается число
дофаминергических нейронов, ослабляется рецепторное связывание
дофамина и ГАМК в оставшихся нейронах, происходит ингибирование
глутаматдекарбоксилазы с подавлением продукции ГАМК. В старости
возрастает количество бензодиазепиновых рецепторов и вследствие этого
усиливается ГАМК-ергическое торможение. Наиболее подвержены
изменениям в связи со старением серотонинергическая, адренергическая и
холинергическая системы. Одна из наиболее тяжелых форм старческой
патологии — болезнь Альцгеймера обусловлена дефектом
ацетилхолинэстеразы. У больных нарушается синтез ацетилхолина и
усиливается его гидролиз, уменьшаются число холинорецепторов и их
способность связывать ацетилхолин. Холинпозитивные свойства ноотропов
позволяют применять их при болезни Альцгеймера наряду с
антихолинэстеразными средствами [35].

Повышение синтеза белка и мембранных фосфолипидов способствует
улучшению регенерации нейронов, активирует их геном и повышает синтез
информационных нейропептидов, интенсифицирует обмен
фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. Показано, что циклогексимид, введенный крысятам на 7-й день постнатального развития, вызывает
расстройства поведения и обучаемости. Введенные с 8-го по 14-й день
ноотропы ликвидируют эти нарушения. Пирацетам стимулирует включение
лейцина в белки мозга, стабилизирует лизосомы нейронов и предотвращает
катаболические процессы в головном мозге при старении [35, 72].
Ноотропные средства улучшают мозговой кровоток и
гемореологические показатели путем расширения мозговых сосудов,
улучшением кровотока в зонах ишемии мозга. Ноотропы препятствуют
развитию отека мозга, блокируют агрегацию тромбоцитов,
тромбообразование, улучшают эластичность эритроцитов и
микроциркуляцию. Никотиновая кислота в составе пикамилона оказывает
прямое сосудорасширяющее и протнвоатеросклеротическое влияние.
Ноотропные средства оказывают антиоксидантный эффект, ингибируя
свободнорадикальное перекисное окисление, защищают от деструкции
фосфолнпиды мембран нейронов, что облегчает фиксации следов памяти.
Липопероксидация усиливается в головном мозге при органических
заболеваниях, старении и стрессе [25, 72].

Кроме того, ноотропные средства потенцируют мнемотропные
эффекты нейропептидов памяти. Пирацетам, пирролидоновое кольцо,
которого не раскрывается с образованием линейной молекулы ГАМК,
является агонистом рецепторов, воспринимающих сигналы от нейропептидов
памяти (фрагменты АКТГ, вазопрессина, субстанции Р). По химическому
строению пирацетам сходен с циклической формой концевой аминокислоты
нейропеппщов памяти — гшроглутаматом и влияет на рецепторы как
экзогенный лиганд. Вероятно, наибольшее значение для стимулирующего
действия пирацетама на первичную обработку информации, хранение
консолидированного следа и его извлечение имеет активация АМРА-
рецепторов глутаминовой кислоты (квисквалатные рецепторы).
Одновременно пирацетам блокирует рецепторы пролина — концевой
аминокислоты нейромедиаторов, нарушающих мнестические функции (пирацетам отличается от пролина отсутствием карбоксила). Таким образом,
можно говорить о существовании специфических «ноотропных» рецепторов головного мозга [25,34, 72,130].

По фармакологическим свойствам ноотропы отличаются от других
психотропных препаратов. Они не оказывают выраженного
психосттгулирующего или седагивного действия, не вызывают
специфических изменений биоэлектрической активности мозга.
Вместе с тем они в той или иной степени стимулируют передачу
возбуждения в центральных нейронах, облегчают передачу информации
между полушариями головного мозга, улучшают энергетические процессы и
кровоснабжение мозга, повышают его устойчивость к гипоксии [33, 35].
Спектр показаний для клинического применения ноотропных
препаратов очень широк. Согласно международной классификации МКБ-10
ноотропные препараты применяют при болезнях класса V «Психические
расстройства и расстройства поведения». Они используются при старении
организма; психоорганических синдромах нейродегенеративного или
сосудистого генеза (сениальные деменции, в том числе болезнь
Альцгеймера); при острых и хронических нарущениях мозгового
кровообращения, в том числе при инсультах и энцефалопатиях; после
черепно-мозговых травм, нейроинфекций, интоксикаций; при остром и
хроническом утомлении, синдроме хронической усталости, при стрессе,
болевых синдромах; при заболеваниях, вызванных длительным приемом
алкоголя и наркотиков, терапией анксиолитиками, антипсихотическими
средствами и другими депрессантами ЦНС; при астеническом, астено-
депрессивном и депрессивном синдромах, невротических расстройствах,
вегетососудистой дистонии, головокружении; для профилактики укачиваний.
В педиатрии ноотропные препараты используют при цереброастенических,
энцефалопатических нарушениях, расстройствах памяти, при задержке
психического и речевого развития, умственной отсталости, при последствиях
перинагального поражения ЦНС, синдроме дефицита внимания с гиперактивностью (СДВГ). Здоровыми людьми ноотропные препараты
используются для повышения умственной работоспособности, концентрации
внимания, улучшения продуктивности работы, организованности,
способности к планированию и принятию решений, увеличению скорости
извлечения памятного следа и объема памяти и т.д. Кроме того, ноотропные
препараты применяются в качестве недопинговых средств в различных видах
спорта [30, 32, 34, 42, 46, 93, 108,119, 124, 129, 143, 155,164].
Таким образом, ноотропные средства обращены к разуму, угасающему
либо в связи с патологическими процессами, либо в результате стресса,
вызванного физическими, химическими, биологическими и социальными
факторами [1, 24,26, 47, 80, 89, 96, 113, 130].
Особенностью применения ноотропных средств является длительность
их приема. Только при достаточно продолжительном курсовом применении
ноотропы оказывают лечебное действие [1, 130].
Побочные эффекты и противопоказания для приема ноотропных
средств могут быть связаны как с индивидуальной непереносимостью, так и
особенностями самих препаратов. Например, пирацетам (ноотропил) может
вызвать появление беспокойства, нарушение сна, обострение коронарной
недостаточности. Он противопоказан при почечной недостаточности. При
применении аминалона (гаммалон, ганеврин) возможно ощущение жара,
диспепсия. Фенибут в первые дни приема может вызвать появление
сонливости, а пантогам способен вызвать аллергические реакции. Пиридитол
(ниритинол, энербол, энцефабол, энцефорт) вызывает головную боль,
тошноту, бессошщу, раздражительность, нарушение сна. Ацефен (аналукс)
может вызвать обострение страха и тревоги. Оксибрал (винкамин)
противопоказан при опухоли мозга [72, 131].

Новые направления поиска ноотропных средств

Пирролидоновые ноотропные препараты — основной класс ноотропов
(пирацетам и его рацетамы) обладают поликомпонентным механизмом
действия, оказывая влияние на все основные системы, вовлекаемые в процессы памяти, что обусловливает их выраженное действие на
мнестические функции. Вместе с тем, они обладают целым рядом побочных
проявлений, не всегда эффективны, не оказывают быстрого действия и для
достижения лечебного эффекта требуется, как правило, их длительное использование [35].

Созданные современные пирролидоновые ноотропные препараты
нового типа (унифирам, нефирацетам, фенотропил, ноопент и др.)
способствуют улучшению процессов обучения и памяти, обладают
противогишжсическим действием, улучшают мозговое кровообращение,
микроциркуляцию, положительно влияют на гемореологические свойства
крови. Усиление метаболизма мозга под влияние данных препаратов
обеспечивается за счет увеличения кругооборота АТФ, усиления синтеза и
метаболизма фосфолипидов. Установлено, что отечественный препарат
фенотропил обладает, наряду с ноотропным действием, выраженным
нейропротекторным эффектом, т.е. способен предупреждать и останавливать
гибель нервных клеток при развивающемся нейродегенеративном процессе
[33].
Кроме того, препараты тгрролидоного ряда входят в состав
комбинированных лекарственных средств, в структуре которых сочетается
ноотропная и вазоактивная субстанция. Вазоактшшые средства, уменьшая
сопротивление церебральных сосудов, вызывают увеличение как суммарного
полушарного, так и регионарного кровотока. Это способствует лучшей
оксигенации головного мозга, нормализации метаболических процессов и
улучшению состояния больных. Большое значение при использовании
вазоактивных средств имеет правильный выбор препарата. Так, данные
препараты (особенно в больших дозах) наряду с расширением мозговых
сосудов могут значительно уменьшить общее периферическое
сопротивление, снизить системное артериальное давление, что в условиях
хронической недостаточности мозгового кровообращения может привести к
прогрессированию шнемических повреждений мозговой ткани. Поэтому для коррекции церебральных сосудистых расстройств желательно применять
препараты, в терапевтических дозах не влияющие на показатели центральной гемодинамики.
Одним из препаратов, представляющих комбинацию ноотропной и
вазоактивной субстанции, является фезам - препарат, содержащий пирацетам
и циннариз1ш. Сочетание этих компонентов усиливает антигипоксическое
действие, уменьшает тонус гладкой мускулатуры сосудов головного мозга.
Фезам обладает умеренной антиагрегантной активностью, стимулирует
обменные процессы в ЦНС, повышает интегративные способности головного
мозга, улучшает память, облегчает процесс обучения. Данный препарат с
успехом применяется при хронической недостаточности мозгового
кровообращения, обусловленной атеросклерозом сосудов головного мозга
или перенесенным инсультом, травмой головного мозга, алкогольной или
наркотической интоксикацией, а также при нарушениях памяти,
концентрации внимания и функций вестибулярного аппарата [97].
> Поиск веществ с ноотропным действием, оказывающих влияние на
холинергическую систему

Процессы памяти тесно связаны с холинергической системой. Дефицит
холинергической передачи занимает одну из ключевых позиций в
нейропатологии сенильной деменции, в том числе болезни Альцгеймера. Для
лечения этих заболеваний широко используются препараты с
холинергическим механизмом действия, которые воздействуют на три
уровня:
1) усиление синтеза ацетилхолина;
2) воздействие на рецепторы;
3) ингибирование ацетилхолинэстеразы.
В последние годы исследователей привлекает фактор роста нервов
(ФРН), нейропептид, содержащий 118 аминокислот, рецепторы которого
находятся на холинергических терминалях в коре и гиппокампе и на
холинергических нейронах сомы. Показано, что введение стимуляторов синтеза ФРН - идебенона или пропентофилина внутрь крысам с поражением
переднего мозга ингибирует активность холинацетилтрансферазы и
ацетшххолинтрансферазы и восстанавливает нарушение поведения и
обучения. Введение этих веществ старым животным повышает сниженный
уровень ФРН в коре и гиппокампе мозга крыс.
Интрацеребральное введение ФРН предотвращает гибель
холинергических нейронов, а также восстанавливает нарушение
просгранственной памяти у крыс с травмой переднего мозга. Введение ФРН
в мозг больных болезнью Альцгеймера увеличивает связывание никотина в
коре мозга и усиливает церебральный кровоток, что свидетельствует о
способности ФРН противодействовать холинергическим дефицитам при этом
заболевании.
Использование стимуляторов синтеза ФРН является одним из новых
подходов к лечению болезни Альцгеймера, а идебенон и пропентофиллин
можно рассматривать как прототипы для будущих разработок веществ такого
типа [32].
Среди производных физостигмина выявлено активное вещество - MF-
201, исследуются и новые ингибиторы холинэстеразы, например, NYK-247
[9-амино-2,3,5,7,8-гексагидро-1Н-циклопента(в)-хинолин] и такрин, которые
обладают высокой избирательной антиамнестической активностью. В
качестве средства, улучшающего память, предложен агонист М-
холинорецепторов - AF — 101 В (цис-2-метилспиро-1,3-октатиолан-5,3-
хинуклидин). Предполагается, что AF — 101 В является перспективным
ноотропом, способным компенсировать дефекты центрального
происхождения холинэргической природы и может рассматриваться как
потенциальный препарат для лечения сенильной деменции.
Одними IB наиболее широко применяемых препаратов обратимых
ингибиторов ацетилхолинэстеразы являются донепезил, ривастигмин и
галантамин, которые препятствуют разрушению ацетилхолина в
синаптической щели [160, 186].

Высокую ноотропную активность, особенно у умственно отсталых
детей и стариков, имеет препарат клерегил (Франция), увеличивающий
содержание холина в мозге и, кроме того, обладающий антиоксидантной
активностью [110].
Глиатилин — центральный холиномиметик, содержит 40,5% холина.
Участвуя в синтезе ацетилхолина, положительно воздействует на
нейротрансмиссию. Глицерофосфат, содержащийся в глиатилине, является
предшественником мембранных фосфолипидов и миелина, поэтому препарат
улучшает мембранную пластичность, функцию рецепторов и синаптическую
передачу. Глиатилин обладает отчетливым ноотропным эффектом, улучшая
познавательные функции, внимание, запоминание и воспроизведение
информации. Способствует устранению эмоциональной неустойчивости,
раздражительности, улучшает настроение. Показан в терапии невротических
постинсультных состояний [73].

Поиск веществ с ноотропным действием, оказывающих влияние на
глутаматергическую систему

Глутаматергическая система играет важную роль в осуществлении высших интегративных функций мозга. ^метил-О-аспартатный (NMDA)
рецепторный комплекс участвует в базисных механизмах синаптической
пластичности, процессах обучения и памяти, а также эта система вовлекается
в патогенез различных заболеваний, сопровождающихся нарушениями
процессов памяти. В частности, показано, что у больных, страдающих деменциями, в том числе и болезнью Альцгеймера, нарушается
чувствительность и связывающая способность NMDA рецепторов в мозге, наблюдается атрофия глутаматергических кортикальных нейронов и
ослабление синаптической пластичности. Это говорит о перспективности поиска ноотропных средств, работающих в этой области.

Мемантин — неконкурентный NMDA антагонист способен улучшать память и обучаемость. Мемантин зарегистрирован в Германии в качестве
средства для лечения деменции и является, таким образом, одним из первых препаратов этой группы, разрешенных к медицинскому применению [32,153].
Нооглютил ((^-5-оксиникотиноил)-Ь-глутаминовая кислота),
созданный в НИИ фармакологии РАМН, обладает выраженным ноотропным действием и значительно превосходит по активности рацетамы.
Он оказывает противогипоксическое действие, улучшает снабжение мозговой
ткани кислородом и предотвращает активацию процессов перекисного окисления липидов при ишемии мозга [26, 32, 33].

Агонисты глицинового сайта.
Глициновый сайт представляет собой структурный участок NMDA рецептора, активация которого лежит в основе
длительной потенциации нейронов гиппокампа, а, следовательно, и усиления синаптической передачи. К препаратам этой группы относят глицин и
милацемид (аналог глицина) и Д-циклосерин, улучшающие память, как в эксперименте, так и у человека.

Глицин — естественный тормозной медиатор нервной системы, действующий как в пределах головного, так и в спинном мозге. Ноотропный эффект препарата сочетается с мягким седативным действием. Глицин обладает некоторой анксиолитической активностью, снижает повышенный мышечный тонус, обладает противосудорожным эффектом. Назначают как дополнительный препарат в терапии ишемии-гипоксии мозга, при лечении неврозов и спастичности.

Соединение CR-2249 - производное глутаминовой кислоты находится
на уровне экспериментальных исследований. Беглимин — производное
беюгидрилглицина обладает высокой ноотропной активностью. Это
соединение было синтезировано в Одесском университете и изучено в НИИ
фармакологии РАМН. Электронная структура беглимина имеет сходство с
пирацетамом, а наличие глицина определяет дополнительные свойства в
спектре действия этого потенциального ноотропного препарата [32].
> Поиск веществ с ноотропным действием, оказывающих влияние на
ГАМК-ергическую систему

Нарушение баланса возбуждающей глутаматергической и тормозной
ГАМК-ергической нейромедиаторных систем приводит к различным
расстройствам функций ЦНС, в том числе к нарушению памяти, поэтому
применение ГАМК-ергических препаратов (аминолон, пикамилон, фенибут,
пантогам и др.) показано при различных нарушениях когнитивных функций.
Аминалон и гаммалон — синтетические аналоги ГАМК, повышающие
устойчивость ЦНС к гипоксии и токсическим влияниям, улучшающие
интегративную деятельность мозга, консолидацию памяти, облегчающие
процессы обучения. Препараты чаще используют при хронической
церебрально-сосудистой недостаточности, динамических нарушениях
мозгового кровообращения, последствиях черепно-мозговой травмы,
токсической энцефалопатии с целью активации психической активности больных.
Пикамилон сочетает свойства ГАМК и никотиновой кислоты, которая
имеет большое значение в процессах тканевого дыхания и обладает
вазоактивными свойствами. Оказывает умеренное ноотропное действие,
анксиолитическую активность (мягкий антидепрессант) и положительное
влияние на процессы микроциркулящш не только в головном, но и спинном
мозге. В неврологической практике препарат используют в раннем и позднем
восстановительном периоде лечения ишемической энцефало- и миелопатии,
при последствиях черепно-мозговой травмы, хронической вертебрально-
базилярной недостаточности (в том числе при дисплазиях позвоночных
артерий), астении различного происхождения, нейросенсорной тугоухости,
атрофии зрительного нерва.
Пантогам и фенибут обладают отчетливым ноотропным действием,
отличающимся «мягким» психостимулирующим влиянием с одновременно
седативным и даже противосудорожным эффектом (более выражен у
пантогама). У больных, перенесших инсульт, использование этих препаратов
целесообразно при наличии неврозоподобных состояний, гиперкинезов,
болевого синдрома, нарушений цикла «сон-бодрствование», судорожного
синдрома.

Препараты янтарной кислоты (когитум и др.) обладают ноотропным
эффектом за счет стимуляции метаболических процессов (янтарная кислота
является субстратом цикла Кребса и непосредственным предшественником
синтеза ГАМК). Используются при состояниях, проявляющихся, прежде
всего, церебральной астенией, при псевдобульбарных нарушениях
(уменьшают гиперсаливацию) [73, 79].

Известно, что бегоодиазепины, особенно в высоких дозах, вызывают
нарушение процесса обучения и памяти у животных и человека, а
антагонисты бензодиазепинового и ГАМК-рецепторов способны устранять
эти нарушения. В последнее время показано, что антагонисты ГАМК- и
бензодиазепиновых рецепторов обладают способностью улучшать процессы
обучения и памяти. Круг этих веществ довольно широк и включает вещества
различной химической структуры и механизма действия: бикуллин,
пикротоксин, флумазенил и другие. На основании этих данных делаются
попытки изыскания новых веществ среди известных групп антагонистов [32,112].

Поиск веществ с ноотропным действием на основе нейропептидов и их аналогов
Положительное влияние ряда известных нейропептидов (вазопрессин,
соматостатин, тиролиберин, АКТГ и другие) на когнитивные процессы
(память, внимание, концентрацию) обусловило поиск ноотропных средств
среди этих эндогенных регуляторов. Этому в значительной мере
способствовало открытие нового класса пептидов, активно участвующих в
нейрогенезе (так называемых нейротрофических ростовых факторов или
нейротрофинов), расшифровка механизмов программируемой смерти клеток
— апоптоза, а также расширение представлений о природе взаимодействия
нервной и иммунной систем и его месте в генезе некоторых форм
церебральной патологии [14].

Другой подход, развиваемый в течение последних 15 лет, может быть
охарактеризован как дизайн олигопептидов с определенным видом
нейротропной активности на основе имитации структуры соответствующего
пептидного прототипа [32].

Введение в структуру пептида фрагмента АКТТ-стабилизирующей
группы (пропи-глищш-пролил) позволило создать препарат семакс,
обладающий выраженными ноотропными свойствами и лишенный
гормональной активности. Семакс улучшает память, внимание, повышает
работоспособность, улучшает адаптационные способности организма к
различным стрессовым ситуациям, эффективен при ишемии мозга, обладает
иммунотропной активностью [178]. Кроме того, семакс обладает
анальгетической активностью [32,115].

В НИИ фармакологии РАМН на основе анализа структур пирацетама и
эндогенных аминокислот (пироглутаминовой и пролина), также содержащих
пирролидоновый цикл, были синтезированы пептидные аналоги пирацетама
- пироглутамил и ацилпролилдипептиды, из которых наиболее эффективным
оказалось соединение этиловый эфир Ы-фенил-Ь-пролил-глицина (ГВС-111
или ноопент). ГВС-111 в дозах, на 3 порядка меньших, чем пирацетам,
улучшал обучаемость, ослаблял влияние различных повреждающих
воздействий на обучаемость и память.

ГВС-111 также оказывает защитное действие при локальной ишемии,
уменьшая вызванный фототромбозом очаг поражения в коре головного мозга
крыс, и восстанавливает когнитивные способности крыс. Показано также,
что ГВС-111 предотвращает накопление диеновых коньюгатов и шиффовых
оснований в мозге и сыворотке крови при иммобилизационном стрессе у
крыс, что указывает на его антиоксидантную активность.
Препараты актовегин и солкосерил содержат пептиды, аминокислоты,
микроэлементы. Ноотропный эффект обусловлен, прежде всего,
трофическим и нейромодуляторным механизмом действия.
Фармакодинамические эффекты актовегина обычно обусловлены именно
входящими в состав низкомолекулярными пептидами. Были доказаны
следующие эффекты препарата: повышение захвата кислорода и усиление
транспорта глюкозы в клетки (последнее описано как инсулиноподобная
активность), повышение утилизации кислорода и глюкозы, стимуляция
синтеза АТФ, улучшение кровоснабжения головного мозга и улучшение
микроциркуляции, оптимизация вигильности и уменьшение концентраций
аммиака и лактата в крови при портальной энцефалопатии и алкогольном
делирии. Эти препараты с успехом применяется при нарушениях
церебрального метаболизма и кровоснабжения, при ожогах и
радиологических травмах.

Церебролизин, цитамины — низкомолекулярные пептиды, полученные
из ткани мозга обладают разнонаправленными эффектами в условиях
хронической церебральной ишемии. Они способствуют восстановлению
межнейрональных связей, проявляют стимулирующее действие,
способствуют восстановлению утраченных функций. Церебролизин
улучшает биоэнергетические процессы в мозге, повышает поступление и
утилизацию глюкозы и кислорода, что приводит к улучшению процесса
аэробного гликолиза, оказывает антиоксидантное действие.
Кортексин - отечественный препарат, содержащий пептиды,
аминокислоты, витамины, микроэлементы и др. Обладает мощным
нейротрофическим эффектом. Используется в ургентной неврологии при
патологических состояниях, сопровождающихся отеком головного мозга [20,
84,96,100, 127, 163].

Антиоксиданты, мембраностабилнзаторы, стимуляторы синтеза белка

Согласно мембранно-синаптической гипотезе памяти, механизм ее
формирования определяется структурно-фукциональными изменениями в
мембране, которые включают стабилизацию конформационных
синаптических мембранных протеиновых макромолекул, в результате чего
происходит активация синаптической передачи. С другой стороны,
вызываемые свободными радикалами поражения в мембране играют важную
роль в старении и в патогенезе различных заболеваний, в том числе
деменций. На основании этого, вещества, обладающие мембрано-
протекторным эффектом, способные противостоять действию свободных
радикалов, рассматриваются как перспективные лечебные средства. К числу
ноотропных препаратов с антиокеидантным механизмом действия относятся:
меклофеноксат, фосфотидилсерин — природный компонент фосфолипидной
мембраны, которые доказали свою эффективность в клинических
исследованиях с применением двойного слепого контроля у больных с
нарушением памяти. Антиоксидантной активностью обладает и ряд других
веществ с ноотропным действием: пиритинол, сабелузол, экстракт женьшеня.
Ноотропной активностью обладает новый применяемый оригинальный
препарат с антиокеидантным механизмом действия — мексидол (2-этил-6-
метил-3-оксипиридин сукцинат). Наряду с выраженным ноотропным
действием, мексидол оказывает противогипоксическое, анксиолитическое,
антистрессорное, церебропротекторное и противосудорожное действие,
устраняет дефициты функций ЦНС при старении, а также обладает
выраженной способностью потенцировать эффекты известных препаратов
[32, 33,45, 75, 86, 99, ПО, 112, 150].


Ноотропные средства растительного происхождения

Без лекарственных растений невозможно представить современную
профилактику и терапию большинства заболеваний, разработку новых
препаратов [8, 9, 10, 27, 64, 67, 71, 87, 101, 122, 123, 134, 154, 158, 161, 167,
168, 170,172, 173,179, 184, 187, 191, 192, 194, 195, 198, 203].

Применяемые и исследуемые в настоящее время синтетические
ноотропные средства эффективны, однако вызывают разнообразные
нежелательные эффекты. Последнее обстоятельство представляется особенно
неблагоприятным, если принять во внимание длительность приема
ноотропных лекарственных средств. Отсюда следует, что поиск новых
эффективных и малотоксичных ноотропных препаратов продолжает
оставаться актуальной проблемой.

Интересным и перспективным является изучение средств природного и, в частности, растительного происхождения,
как потенциальных источников новых ноотропных лекарственных средств,
отличающихся малой токсичностью, большей частью мягкостью действия и
редким индуцированием аллергических реакций [70, 81, 176].

Анализ литературных данных свидетельствует о создании новых
ноотропных препаратов на основе лекарственных растений, таких как
шлемник байкальский, пион уклоняющийся, родиола розовая, женьшень,
лимонник китайский, астрагал монгольский, гинкго билоба, бадан
толстолистный, княжик сибирский и др.

Пеонифлорин, полученный из пиона, уменьшает нарушения обучаемости в результате снижения числа ошибок при воспроизведении пищедобывательного навыка [201].

Препараты, содержащие стандартизированный экстракт африканского дерева гинкго билоба (билобил, танакан, мемоплант, гинкго билоба и др.),
обладают ноотропной активностью и практически не вызывают побочных эффектов. Основными действующими веществами экстракта являются
флавоноидные гликозиды, терпеновые лактоны и гинкголиды, оказывающие разнонаправленное положительное воздействие на различные звенья
патогенеза заболевания. Под воздействием гинкго билоба нормализуется тонус артерий и вен, улучшаются реологические свойства крови (снижается
степень агрегации тромбоцитов и нейтрофилов, повышается эластичность мембран эритроцитов и их способность к деформации при прохождении ими
капиллярного русла), улучшается снабжение ишемизированной ткани кислородом и глюкозой, ускоряются процессы выведения углекислого газа и
молочной кислоты. Мощное антиоксидантное действие компонентов растения позволяет защитить клетки головного мозга от разрушительного
воздействия свободных радикалов при окислительном стрессе, который развивается при ишемических состояниях и старении организма Гинкго
билоба так же воздействует на высвобождение, повторное поглощение и катаболизм нейромедиаторов и, возможно, на их способность к соединению с мембранными рецепторами [15, 55,128,193,196].

Сухой экстракт шлемника байкальского обладает широким спектром фармакологической активности: нормализует процессы обучения и памяти в
условиях высокого психоэмоционального напряжения, а также при ослаблении интегративных и мнестических функций мозга при их
нарушении в результате воздействия ряда факторов физической и химической природы или вследствие ишемии мозга; обладает выраженным анксиолитическим, стресспротективным и антиоксидантным действием [40,85, 94].
Большой интерес представляют лекарственные растения, содержащие фенилпропаноиды, для которых обнаружены тонизирующие, адаптогенные, иммуномодулирующие и ноотропные свойства [87].

Положительные результаты получены при действии экстракта родиолы розовой и выделенных из него соединений - салидрозида и розавина, на
показатели познавательных функций при выработке активных и пассивных избеганий на белых беспородных крысах и мышах. При этом установлено,
что экстракт родиолы и салидрозид оказывают церебропротекторное действие в условиях гипоксии. Розавин повышает выносливость животных
по сравнению с экстрактом, салидрозидом и более эффективен при амнезии, вызванной повреждением мозга путем электрошока [3, 152].
Установлено, что лекарственное средство, содержащее экстракты туйи восточной, женьшеня и шлемника, оказывает благотворное влияние на
память, обучение интактных и с нарушенной обучаемостью мышей на моделях пассивного и активного избегания, укрытия на платформе и нажатия нарычат [189].

Экстракт астрагала монгольского обладает анксиолитическим эффектом, вызывает активацию двигательной активности животных в условиях принудительного плавания [77, 78, 105].
Определенный интерес' представляют результаты изучения экстракта из зеленых листьев бадана толстолистного, который улучшает условно-рефлекторную деятельность в условиях стресса и конфликтной ситуации,
оказывает благоприятное влияние на процессы обучения и памяти, обладает антигипоксическими свойствами [44].

При исследовании влияния экстракта из надземной части княжика сибирского выявлено его антистрессорное, транквилизирующее действие,
способность улучшать физическую работоспособность, условно-рефлекторную деятельность и поведение животных после перенесенной
гипоксической травмы и в условиях экспериментальной ишемии головного мозга [138, 144, 145, 146, 147].

При исследовании сохранности условного рефлекса пассивного избегания и принудительном плавании животных с утяжеляющим грузом обнаружены ноотропные и адаптогенные свойства надземной части лабазника вязолистного [28, 88].

Нейропсихические исследования подтвердили положительное действие комплексного растительного средства, состоящего из шлемника байкальского,
горца птичьего, сушеницы топяной, плодов шиповника, курильского чая, шюна уклоняющегося и кровохлебки, на когнитивные функции. Отмечено
улучшение психических функций, прежде всего внимания и умственной работоспособности [82].

На основе экстракта корня белого женьшеня Panax ginseng С.А. Меу., выращиваемого в Швейцарии, разработано и выпускается лекарственное
средство гинсана (фирма Pharmaton, Швейцария). Его клинический эффект основан на повышении уровня кислорода клетками организма и ускорении
его транспортировки; повышении потребления кислорода; улучшении клеточного обмена веществ; уменьшении содержания молочной кислоты;
уменьшении усталости и боли в мышцах, ускорении восстановления после физической нагрузки.
Стандартизация препарата проводится методом ВЭЖХ по сумме тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда [128, 183, 190].

Способность растительных препаратов, издревле используемых для улучшения познавательной деятельности, в последние годы получила подтверждение исследованиями механизмов действия растительных компонентов на клеточном уровне. Установлено, что биологически активные
вещества растений при комплексном их применении могут обеспечить защиту центральных нейронов от повреждений, усилить процессы регенерации в головном мозге и улучшить мозговую гемодинамику [16].

Выводы по 1 главе:
1. Анализ данных литературы по ноотропным препаратам, их механизмам действия и особенностям применения (показания и противопоказания к применению) показал, что исследования растительных объектов с целью дальнейшего применения в медицинской практике продиктовано малой токсичностью, невысокой стоимостью и исключительными лечебными свойствами последних.

2. Согласно данным литературы, альфредия поникшая {Alfredia cernua (L.) Cass.) - многолетнее растение флоры Сибири, используемое в народной медицине при нервных заболеваниях. Химический состав растения практически не изучен.

3. Имеющийся многолетний опыт выращивания культивируемой альфредии поникшей свидетельствует о перспективности заготовки сырья в промышленных масштабах для создания нового ноотропного фитопрепарата.

Глава 2. Объект и методы исследования

2.1. Объект исследования
Объектом исследования явилась надземная часть альфредии поникшей
(олиственная верхняя часть растения и прикорневые листья), собранная в
2001 - 2007 гг. в фазы вегетации, бутонизации, цветения и плодоношения
вдоль реки Инжуи в Ширинском районе Республики Хакасия, в окрестностях
перевала Ябочанский Усть-Канского района, в окрестностях Семинского
хребта Онгудайского района, в окрестностях поселка Шебалино
Шебалинского района Республики Горный Алтай, в долине реки Ануй
Солонешенского района Алтайского края и на экспериментальной базе
33
Сибирского ботанического сада Томского государственного университета.
Высушенное воздушным способом сырье измельчали и просеивали
через сито с диаметром отверстий 7 мм. Для исследований использовали
сырье с содержанием влаги от 7,65 до 12,70 %.
2.2. Методы исследований
Определение морфологических признаков сырья проводили в
соответствии со статьей «Методы анализа лекарственного растительного
сырья» ГФ XI [38].
Для микроскопического анализа сырье готовили следующим образом:
- органы растений помещали в смесь глицерин:этанол:вода (1:1:1) и выдерживали не менее 2 суток;
— листья обесцвечивали кипячением в течение 1 -2 мин в колбе с 2,5 % раствором натрия гидроксида. Затем их тщательно промывали водой;
— лепестки венчика выдерживали в горячей воде 1-2 мин;
- препараты из всех органов растений рассматривали в глицерине [126].

Приготовление и просветление препаратов проводили в соответствии
со статьями «Методы анализа лекарственного растительного сырья»,
«Техника микроскопического и микрохимического исследования
лекарственного растительного сырья» ГФ XI [38]. Просмотр и
фотографирование срезов выполняли с помощью микроскопа Carl Ziess
(увеличения 7x1,5x4,5; 7x1,5x8; 7x1,5x20; 7x1,5x40), цифрового
фотоаппарата «Olympus Camedia» digital compact camera C-4000 zoom и
оптико-механического согласователя [17]. Снимки, представленные на
рисунках, обрабатывали на компьютере в программе «Adobe Photoshop 7.0».
Качественный состав и количественное содержание природных
соединений альфредии поникшей исследовали с помощью современных
методов и приемов фотохимического анализа. Для получения экстрактов
использовали следующие растворители: вода, этанол различной
концентрации, метанол и хлороформ.

Методы выявления и количественного определения биологически
активных веществ.
Для обнаружения флавоноидов использовали следующие реакции:
а) цианидиновую пробу Дж. Синода и ее модификацию по К.Брианту:
после проведения цианидиновой пробы реакционную смесь разбавляли
равным количеством окганола и после разделения фаз наблюдали окраску.
Окрашивание октанольного слоя указывало на агликоновую природу
исследуемого вещества, а водного слоя — гликозидную природу вещества;
б) реакцию с 1 % раствором алюминия хлорида на 95 % этаноле;
в) реакцию с борно-лимонным реактивом [49, 139].
Обнаружение дубильных веществ и определение их групповой
принадлежности осуществляли следующими реакциями:
г) с 1 % раствором желатина;
д) с 1 % раствором железоаммонийных квасцов;
е) с формальдегидом и хлористоводородной кислотой [103, 139];
Для обнаружения сапонинов использовали:
ж) гемолитическую пробу;
з) способность к пеяообразованию;
и) реакцию Либермана-Бурхарда;
а также реакции:
к) с 25 % раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты на 95 % этаноле;
л) с концентрированной серной кислотой [18].
Для обнаружения иридоидов применяли реакцию с реактивом Трим-
Хилла, Бекона-Эдельмана и гидроксамовую пробу [36].
Наличие аминокислот определяли по реакции со свежеприготовленным
0,2 % раствором нингидрина на 95 % этаноле [22, 54].
Хроматографирование на бумаге проводили в различных системах
растворителей.
Для обнаружения свободных Сахаров:
• Бутанол-1 - пиридин - вода 6:4:3 [23].

Детекцию Сахаров осуществляли анилинфталатным реактивом [43].
Для обнаружения фенольных соединений:
• 15 %, 30 % и 60 % растворы уксусной кислоты;
. Бутанол-1 - этанол - вода 5:1:2;
• Бутанол-1 - уксусная кислота - вода 4:1:5;
• Хлороформ [139].
На хроматограммах фенольные соединения обнаруживали по характеру
свечения в фильтрованном УФ — свете (со светофильтром с длиной волны
254 нм) до и после обработки различными реактивами [36, 139]:
а) флавоноиды: парами аммиака, 1 и 5 % раствором алюминия хлорида,
диазореактивом;
б) кумарины: парами аммиака, раствором щелочи на 95 % этаноле (6 г
калия гидроксида, 25 мл воды, 45 мл 95 % этанола), диазореактивом;
в) фенолкарбоновые кислоты: парами аммиака, раствором щелочи на
метаноле, диазореактивом [19, 63,151].
Хроматографирование в тонком слое силикагеля осуществляли в
различных системах растворителей.
Для обнаружения иридоидов:
. Изопропанол - вода 4:1.
В качестве детектора на иридоиды использовали реактив Бекон-
Эдельмана и гидроксамовую пробу [103, 139].
Для выявления экдистероидов:
. Хлороформ - этанол 4:1,
• Хлороформ - метанол - ацетон 6:2:1.
Детекцию экдистероидов осуществляли ванилин-серным реактивом
[151].
Для обнаружения аминокислот:
. Бутанол-1 - этанол - вода 10:2:4.
Аминокислоты обнаруживали на хроматограмме свежеприготовленным
0,2 % раствором нингидрина на 95 % этаноле [22, 54].

Для выявления каротиноидов:
• Гексан - этанол 9:1.
Обнаружение каротиноидов осуществляли по характеру свечения в
фильтрованном УФ — свете (длина волны Хт^ 254 нм) до и после обработки
10 % раствором фосфорно-молибденовой кислоты [132].
Для выявления сапонинов:
. Хлороформ - метанол 25:3;
• Хлороформ - метанол - вода 70:23:1.
Для детекции сапонинов на хроматограммах применяли ванилин-
фосфорный реактив [151].
Для выявления алкалоидов:
• Хлороформ - этанол 9:1.
Обнаружение алкалоидов на хроматограммах осуществляли по
характеру свечения в УФ — свете (длина волны А^а* 254 нм) до и после
обработки концентрированной серной кислотой, реактивом Драгендорфа,
парами йода [151].
Исследование на наличие сесквитерпеновых лактонов проводили
методом, предложенным К. С. Рыбалко (1978).
Обнаружение и количественное определение углеводов проводили
антронным методом [74].
Количественное определение фенолкарбоновых кислот осуществляли
спектрофотометрическим методом [58,137].
Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья, проходящего сквозь
сито с отверстиями диаметром 2-4 мм, помещали в колбу вместимостью
100 мл и прибавляли 12 мл 70 % этанола. Колбу с содержимым присоединяли
к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане при температуре
80 °С в течение 30 мин. Затем содержимое колбы охлаждали, фильтровали
через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл. Процесс
экстрагирования повторяли два раза, полученное извлечение фильтровали в
ту же колбу, сырье промывали 15 мл 70 % этанола. Содержимое колбы

доводили до метки 70 % этанолом (раствор А).
0,5 мл раствора А помещали в мерную колбу на 25 мл, доводили объем
раствора до метки 70 % этанолом и измеряли оптическую плотность раствора
на спектрофотометре СФ - 2000 при длине волны 325 нм в кювете с
толщиной слоя 10 мм.
В качестве раствора сравнения использовали 70 % этанол.
Содержание фенолкарбоновых кислот в процентах (X) в пересчете на
хлорогеновую кислоту в воздушно-сухом сырье вычисляли по формуле:
Р-50-25-100
504,425-m-0,5-(\00-W}'
где D - оптическая плотность анализируемого раствора;
m - навеска сырья, г;
504,425 - удельный показатель поглощения Е™ хлорогеновой кислоты
при 325 нм;
50, 25 - объем мерной колбы, мл;
0,5 - объем аликвоты, мл;
W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Количественное определение полисахаридов осуществляли
спектрофотометрическим методом [21].
Около 3,0 г (точная навеска) сырья, проходящего сквозь сито с
диаметром отверстий 2 мм, помещали в коническую колбу на 250 мл,
прибавляли 40 мл смеси этанола и воды (3:1), 0,3 г кальция карбоната и
нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30
мин. Горячее извлечение осторожно сливали, следя за тем, чтобы частицы
сырья остались в колбе. Колбу с сырьем промыли дважды, используя по 10 мл
смеси этанола с водой (3:1), извлечение сливали. Операцию экстрагирования
повторяли с 30 мл смеси этанола с водой (3:1), время нагревания 15 мин.
Полученные извлечения отбрасывали.
В колбу с сырьем приливали 40 мл воды, нагревали на кипящей
водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Полученное

извлечение, после 5 мин охлаждения, фильтровали через бумажный фильтр в
мерную колбу вместимостью 100 мл, колбу с сырьем промывали 10 мл воды,
извлечение фильтровали в ту же мерную колбу. Сырье переносили на фильтр,
промывая коническую колбу дважды, используя по 10 мл воды. Объем
раствора доводили до метки, затем перемешивали (раствор А).
10 мл раствора А помещали в ампулу, прибавляли 3 мл
концентрированной хлористоводородной кислоты, ампулы запаивали и
нагревали в сушильном шкафу при температуре 105°С в течение 10 ч. К
полученному гидролизату прибавляли 40 % водный раствор натрия
гидроксида до достижения рН раствора 4,0 - 4,5. Полученный раствор
количественно переносили в колбу вместимостью 25 мл и доводили объем до
метки. Извлечение фильтровали через бумажный фильтр, отбрасывая первые
5 мл фильтрата (раствор Б).
В три конические колбы помещали по 2,5 мл 1 % раствора пикриновой
кислоты и по 7,5 мл 20 % раствора натрия карбоната. В первую колбу
прибавляли 5 мл раствора Б, во вторую 5 мл воды (раствор сравнения), в
третью 5 мл раствора глюкозы (РСО). Колбы с содержимым погружали на 30
мин в кипящую водяную баню, затем охлаждали до комнатной температуры.
Содержимое количественно переносили в мерные колбы вместимостью 25
мл, доводили водой до метки, перемешивали и измеряли оптическую
плотность анализируемых растворов и раствора РСО глюкозы относительно
раствора сравнения на спектрофотометре СФ — 2000 при длине волны 470±2
нм.
Содержание суммы полисахаридов в процентах (X) рассчитывали по
формуле:
/ут-100-25-25-5-100-100
~ D-mx-\Q-5-25Q-25-(\№-W)'
где D S H D - оптическая плотность анализируемого раствора и раствора
сравнения соответственно;
m — масса навески РСО глюкозы в пересчете на безводную глюкозу, г;
mx - масса навески сырья, г;
25, 100, 250 - разведение, мл;
5,10 — аликвота, мл;
W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление раствора глюкозы: 0,05 г (точная навеска) РСО глюкозы
растворяли в мерной колбе на 250 мл в воде, доводили до метки.
Масса навески безводной глюкозы тя/=т —,
б / в 100
где W — влажность глюкозы, %.
Количественное определение общего азота проводили по методу
Кьельдаля [74].
Обнаружение и количественное определение аминокислот
осуществляли на аминокислотном анализаторе A0326V2 (Knauer, Германия).
Около 10,0 г (точная навеска) сырья, проходящего сквозь сито с
диаметром отверстий 2 мм, помещали в коническую колбу на 500 мл,
прибавляли 200 мл воды и экстрагировали 30 минут при температуре 60°С.
Полученное извлечение сливали. Экстракцию повторяли дважды. Извлечения
объединяли и выпаривали при температуре не выше 50°С досуха.
50 мг пробы переносили в ампулу из толстого стела 12x120 мм и
добавляли 20 мл 6 н. хлористоводородной кислоты. Ампулу запаивали,
гидролиз сухого остатка проводили в термостате при 110°С в течение 22
часов. После гидролиза содержимое ампулы охлаждали, фильтровали и
переносили в выпарительную чашку. Выпаривание производили на кипящей
водяной бане. Сухой остаток растворяли в 20 мл буфера рН 2,2, отбирали
1900 мкл и добавляли 100 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). 100 мкл
раствора пропускали через специальный патрон для очистки раствора
аминокислот от примесей. Патрон промывали 1000 мкл буфера (буфер рН2,2
+ 5 % ДМСО). Анализ проводили на аминокислотном анализаторе A0326V2
(Knauer, Германия). На колонку A0992-13vl наносили 20 мкл образца, в
качестве подвижной фазы использовали последовательность из четырех
цитратных буферных растворов различной кислотности и ионной силы
(скорость потока буфера - 0,22 мл/мин, реагента - 0,2 мл/мин).
Детектирование проводили с использованием постколоночного окрашивания
раствором нингидрина при длине волны 570 нм. Количественное
определение аминокислот проводили с использованием стандартных
растворов аминокислот (Pickering).
Эмиссионный спектральный анализ проводили на кварцевом
спектрографе ИСП-28 с микрофотометром МФ-2 [38].
Элементный состав проб исследовали на масс-спектрометре с
индуктивно-связанной плазмой X Series II (Thermo Fisher Scientific, США).
Около 0,15 г пробы растворяли в 3 мл свежеперегнанной концентрированной
азотной кислоты и помещали в систему микроволнового разложения Mars 5
(Berghoff,CUJA)[188].
Результаты количественных определений подвергали математической
обработке методом вариационной статистики по ГФ XI [38].
Хромато-масс-спектроскопию (ГХ/МС) проводили на приборе Trace
DSQ (Thermoelectron согр.) с программным обеспечением Xcalibur 1.4.
Разделение проводили на колонке ВРХ5 длиной 25м, в режиме
программирования температур (Тнсп = 280°С, Ттсрмостата от 70 до 290°С,
скорость нагрева 15°/мин, 290°С - 90мин). Vr/H = 1 мл/мин, в качестве
растворителя использовали хлороформ, задержка хроматограммы 5 мин.
Детектирование масс-спектров проводили по полному ионному току в
интервале масс от 33 до 600 а.е.м. В качестве основных критериев при
выборе предполагаемой структуры использовали время удерживания и масс-
спектры пиков на ГЖХ, а также сравнения полученных масс-спектров с масс-
спектрами стандартных веществ различных баз данных [165].
Для разделения сложных смесей веществ и выделения индивидуальных
соединений (тритерпеновых соединений, флавоноидов, лигнанов,
органических кислот) использовали методы избирательной жидкостной
экстракции, адсорбционной колоночной хроматографии на полиамиде,
силикагеле, хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.
Для колоночной хроматографии использовали силикагель марки
Lachema (Чехия) L 100/250, 100/40, соотношение фракции и сорбента от 1:7
до 1:25. Для флэш-хроматографии применяли силикагель марки Lachema
(Чехии) L 5/40 (соотношение фракция - сорбент от 1:6 до 1:15), полиамид
марки "Woelm" (Германия) (соотношение фракция — сорбент 1:10) [2, 140].
С целью подбора элюентных систем, контроля за ходом разделения
смесей веществ на колонках и чистотой полученных соединений применяли
метод хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках "Silufol TJV -
254м (Kavalier, Чехия), "Sorbfil" (Россия), "Lucefol" (Kavalier, Чехия), "Alufol"
(Kavalier, Чехия), а также метод восходящей хроматографии на бумаге марки
"Ленинградская М" (Россия), FN-4 (Германия). Хроматографирование
осуществляли в выбранной системе растворителей при температуре 19 - 23°С
в герметически закрытых стеклянных камерах.
Для аналитического и препаративного разделения использовали
следующие системы растворителей:
- хлороформ - метанол - вода 70:12:1 (1), 70:23:1 (II), 70:23:4 (III),
63:23:3 (IV);
- хлороформ - метанол 25:3 (V);
- хлороформ - этанол 8:2 (VI);
- гексан - ацетон 8:2 (VII);
- этилацетат - метанол - вода 10:2:3 (VIII);
- бутанол-1 - этанол - вода 10:2:4 (IX);
- этилацетат - муравьиная кислота - вода 8:1:1 (X);
- этилацетат - уксусная кислота - вода 10:4:1 (XI);
- уксусная кислота 1 % (XII), 5 % (XIII), 15 % (XIV), 30 % (XV), 60 %
(XVI), ледяная (XVII).
Исследуемые образцы наносили при помощи капилляров и
калиброванных пипеток.
Растворители для хроматографии и реактивы использовали марки ХЧ и
ЧДА. В некоторых случаях растворители (хлороформ, ацетон) дополнительно
очищали, отбирая фракции, кипящие в интервале не более 1 °С. Соотношение
растворителей брали в объемных частях. Все величины Rf обнаруженных
соединений являются средними из 5-ти измерений.
Все растворы (экстракты, элюаты с колонок, хроматограмм и т.д.)
упаривали в вакууме при температуре не выше 50°С.
Все вещества перед анализом высушивали в течение 4 - 5 ч в вакуум -
пистолете над пятиокисью фосфора при 80 - 110°С и 226,6 Па.
Температуру плавления определяли в блоке Кофлера. Оптическое
вращение измеряли при 580 нм на поляриметре «Polamat А».
Электронные спектры соединений в ультрафиолетовой и видимой
областях снимали на саморегистрирующих спектрофотометрах СФ - 2000
(Россия) и "UVIKON 943 Dable Beam UV/VIS" (Италия) в кюветах с
толщиной поглощающего слоя 1 см, в качестве растворителей применяли
абсолютные метанол и этанол. Спектры поглощения соединений получали в
концентрациях 1 х 10"3, 2х 10"3 %.
ИК-спектры получали на спектрометре Nicolet 5700 (FT-1R) (США) в
таблетках калия бромида и хлороформном растворе.
Спектры ЯМР записывали на спектрометре «Bruker DRX-400» и
«Bruker DRX-500» (рабочая частота - 500,13 МГц для 1Н, 125,76 МГц для
13С) с применением стандартных программ фирмы «Bruker». С
использованием метода HSQC выявлены химические сдвиги С атомов,
связанных с протонами (С-Н корреляция). Связи 13С (особенно для
четвертичных атомов) и 'Н атомов через 3-5 связей установлены НМВС-
корреляцией. Химические сдвиги между соседними !Н атомами определены
методом COSY. Относительная стереохимия молекул определена путем
анализа кросс-пиков между протонными сигналами в спектрах ROESY и
NOESY. Масс-спектры (ЭУ, 70 эВ) получали на приборе «Finnigan МАТ 8200»
[68, 98].
Товароведческий анализ сырья (определение экстрактивных веществ,
влажности, общей золы, золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте,
примесей, измельченности сырья) проводили в соответствии сГФ XI [38].
Получение экстрактов надземной части альфредии поникшей. Для
скрининговых фармакологических исследований экстракты надземной части
растения получали следующим образом: высушенное сырье измельчали до
размера частиц 2 — 4 мм и трижды экстрагировали с обратным
холодильником на водяной бане при температуре 80-85 °С в течение 30 мин.
В качестве экстрагента использовали воду, 40 %, 70 % и 95 % этанол в
соотношении 1:7. Извлечения объединяли, фильтровали через четыре слоя
марли и упаривали под вакуумом при температуре не выше 60°С.
Жидкий экстракт альфредии поникшей получали методом
противоточной экстракции в батарее из 5 перколяторов в три цикла с
временем настаивания 24 часа [83].
Стандартизацию жидкого экстракта альфредии проводили в
соответствии с требованиями ГФ XI [39].

Испытания на микробиологическую чистоту растительного сырья и
экстракта проводили в соответствии с требованиями ОФС 42-0067-07,
Категория 4Б.

Глава 3. Фитохнмическая характеристика основных групп биологически
активных веществ н элементный состав надземной части альфредии
поникшей

Обнаружение отдельных классов природных соединений в надземной
части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей проводили
общепринятыми приемами и методами фотохимического анализа [139, 149].
В результате исследования нами выявлены следующие группы
биологически активных веществ (БАВ): флавоноиды, кумарины,
фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, тритерпеновые соединения,
стерины, полисахариды, аминокислоты, каротиноиды [148]. В надземной
части альфредии поникшей не обнаружены сесквитерпеновые лактоны,
иридоиды, экдистероиды, алкалоиды и антраценпрошводные соединения.

Методами, описанными в главе 2, определено количественное содержание
основных групп БАВ. Полученные результаты обнаружения и
количественного определения основных групп БАВ приведены в таблице 1.
Таблица 1 — Биологически активные вещества надземной части
дикорастущей альфредии поникшей
Группы БАВ
Простые фенолы
Лигнаны
Флавоноиды
Кумарины
Органические
кислоты
Дубильные
вещества
Тритерпеновые
соединения
Стерины
Каротиноиды
Полисахариды
водорастворимые
Азотсодержащие
соединения
Аминокислоты
Состав
+
Арктиин
Кверцетин, кемпферол, таксифолин,
апигенин, лютеолнн, юокверцитрин,
лютеолин-7-глюкозид, рутин
Эскулетин
Бензойная, салициловая, ванилиновая,
коричная, кофейная, хлорогеновая, хинная
Гидролнзуемые и конденипюванные
а- и р-амирин
Р-ситостерин
+
D-глюкоза, D-галактоза, L-арабиноза, D-
глюкуроновая кислота
+
Аспарагиновая и пгуташшовая кислоты,
серии, пролин, глицин, аланин, цистеин,
изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин,
валин, гистидин, метионин, лизин, треонин,
триптофан
Количественное
содержание, %
#
#
0,81±0,08
#
3,33±0,49
Следовые количества
#
#
#
2,27±0,33
13,75±2,45
2,98±0,13
Примечание: знаком (+) отмечено наличие веществ, знаком (#) —
определение не проводилось.
Исследование аминокислотного состава альфредии поникшей
проводили на ашшокислотном анализаторе. В результате исследования
установили наличие 15 аминокислот (рис. 1, табл. 2), семь из которых
являются незаменимыми (лизин, треонин, валин, изолейцин, лейцин,
фенилаланин, гастидин). Общее содержание аминокислот в надземной части
растения составляет 2,98% (в т.ч. 1,06% — незаменимые), что является
достаточно высоким показателем для растений. В преобладающей
концентрации в альфредии поникшей присутствуют глутаминовая и
45
аспарагиновая кислоты, пролин, аланин, валин, глицин, лизин и лейцин.
Кроме того, обнаружены серии, цистеин и тирозин. Обладая широким
спектром фармакологического действия, аминокислоты придают другим
веществам легкоусвояемую и безвредную форму, одновременно потенцируя
их эффект, участвуют в процессах нервной и сосудистой регуляции
различных функций организма.
Относит,
интенсивность
t, мин
Рисунок 1- Ионообменная хроматограмма водного экстракта
альфредии поникшей.
Таблица 2 - Содержание суммы свободных и связанных аминокислот
в надземной части альфредии поникшей
Наименование
Аспарагиновая кислота
Треонин
Серии
Глутаминовая кислота
Пролин
Глицин
Аланин
Валин
Цистеин
Изолейцин
Лейцин
Тирозин
Фенинлаланин
Гистидин
Лизин
Время удерживания
на хроматограмме,
мин
9,25
13,12
15,36
19,15
29,11
30,18
32,54
38,32
40,46
42,24
43,38
45,45
47,61
52,10
55,44
Количественное содержание, %
0,39
0,13
0,13
0,70
0,16
0,17
0,28
0,18
0,03
0,14
0.17
0,10
0,13
0,10
0,17
В ходе исследования установлено, что качественный состав БАВ культивируемой альфредии поникшей идентичен химическому составу
дикорастущего растения. Количественное содержание основных групп БАВ
(флавоноидов, фенолкарбоновых кислот) в надземной части культивируемого
растения также сопоставимо с содержанием их в дикорастущем растении.
Так, содержание флавоноидов в дикорастущем образце составляет 0,81±0,08,
а в культивируемом - 0,92±0,06, содержание органических кислот 3,33±0,49 и
2,57±0,25 соответственно.
Альфредия поникшая, выращенная в условиях открытого участка
Сибирского ботанического сада Томского государственного университета,
накапливает несколько больше БАВ, чем растение, выращенное в тени.
Например, в условиях открытого участка определяется 5,00±0,84 %
органических кислот и 1,53±0,24 % флавоноидов, в то же время, в полутени
их содержание снижается до 1,58±0,27 % и 0,48±0,09 % соответственно.
Проведенные исследования свидетельствуют о перспективности дальнейшего
изучения альфредии поникшей, культивируемой в условиях юга Томской
области [6].
Элементный состав альфредии поникшей определяли методом
эмиссионной спектрометрии в зольном остатке после сжигания травы
(табл. 3). Проведенные исследования выявили наличие 28 элементов, шесть
из которых относят к макроэлементам, 10 являются микро- и 13
ультрамикроэлементами. Среди обнаруженных элементов 18 -
эссенциальные или условно эссенциальные.
На основании полученных данных составлен ряд предпочтительного
накопления элементов: K>Ca>P>Na>Sn>Mg>Al>Si>Ba>Fe>Sr>Mn>B>Ti>
Cu>Zn>Zr>Li>Ni>Pb>V>Cr>Mo>Sc>Y>Ga>Be>Ag, который показывает, что
в значительных количествах в надземной части растения обнаружены калий,
кальций, фосфор, натрий, олово и магний. Далее следует группа элементов,
содержащихся в меньших количествах: алюминий, кремний, барий, железо и
пр. В гораздо меньших концентрациях присутствуют ванадий, хром,
молибден, скандий и др. В исследуемом объекте на уровне предела
обнаружения методом эмиссионной спектрометрии выявлены хром, ванадий,
цирконий, галлий, бериллий и скандий.
Сравнительный анализ элементного состава золы надземной части
альфредии поникшей и средних значений содержания элементов в золе
растений по С. М. Ткаличу [121] показал, что альфредия поникшая
накапливает большие количества калия (в 10 раз), кальция (в 7 раз), бария (в
15 раз), олова (в 20 раз), стронция (в 13 раз), а также содержит цирконий и
скандий, данные по которым, в растительных объектах, С. М. Ткаличем не
приведены.

Полученные результаты могут свидетельствовать как о влиянии места
произрастания (например, месторождениях олова), так и об индивидуальных
особенностях растения (накопление значительных количеств калия, кальция,
бария и стронция).

Выводы по 3 главе:
1. В надземной части альфредии поникшей установлено наличие
флавоноидов, лигнанов, кумаринов, органических кислот, дубильных
веществ, тритерпеновых соединений, стеринов, полисахаридов, аминокислот
и каротиноидов. Изучен состав основных групп биологически активных
веществ и определено их количественное содержание.
2. В результате исследования установлена идентичность качественного
состава и сопоставимость количественного содержания основных групп
биологически активных веществ дикорастущей и культивируемой альфредии
поникшей.
3. В элементном составе надземной части альфредии поникшей в
преобладающих концентрациях определены калий, кальций, фосфор, натрий,
олово и магний. Обнаруженные элементы могут принимать участие в
проявлении фармакологической активности.
Глава 4. Способы получения и идентификация биологически активных
веществ фармакологически активного экстракта альфредии поникшей
и его фракций
В результате экспериментального фармакологического исследования
установлена ноотропная активность экстрактов надземной части альфредии
поникшей, причем наиболее выраженный эффект оказывает экстракт
растения на 70 % этаноле [29]. Экстракт надземной части культивируемой
альфредии поникшей на 70 % этаноле обладает равноценной активностью.
Эффективность исследуемых экстрактов превосходит активность препарата
сравнения «Гинсана» и соответствует таковой пирацетама (см. Приложение).

С целью разработки рационального способа получения
фармакологически активного экстракта альфредии поникшей исследовали
зависимость выхода целевого продукта от соотношения сырье-экстрагент,
температурного режима, времени экстракции и степени измельчения сырья.
При получении экстракта следует использовать соотношение сырье-
экстрагент 1:20, что является решающим фактором оптимизации процесса
экстракции (табл. 4). Сдвиг его в сторону уменьшения количества
экстрагента приводит к снижению выхода целевого продукта, а увеличение
количества экстрагента нерационально, так как выход готового экстракта
возрастает не значительно. Экстракцию растительного сырья следует
осуществлять при температуре 80°С, так как понижение температуры
приводит к уменьшению выхода целевого продукта за счет уменьшения его
растворимости, а повышение температуры нерационально вследствие
незначительного возрастания выхода экстракта (табл. 5). Наиболее
оптимальным временем экстракции является 90 мин. В случае уменьшения
продолжительности процесса происходит снижение выхода целевого
продукта за счет уменьшения промежутка непосредственного контакта
сырье-экстрагент, а дальнейшее увеличение временного фактора
нерационально, так как выход экстракта не повышается (табл. 6). В
результате установлено, что наибольший выход экстракта наблюдается при
степени измельчения сырья 2 мм, т.к. при большем или меньшем измельчении
снижается выход веществ (табл. 7).

Примечание: экстрагент - 70 % этанол, степень измельчения сырья -
2 мм, время экстракции - 90 мин, температура экстракции — 80 °С.
Таблица 5 - Влияние температурного режима
на выход экстракта альфредии поникшей

Примечание: экстрагент - 70 % этанол, степень измельчения сырья -
2 мм, соотношение сырье - экстрагент - 1:20, время экстракции - 90 мин.

Примечание: экстрагент - 70 % этанол, степень измельчения сырья -
2 мм, соотношение сырье - экстрагент - 1:20, температура экстракции —
80 °С.
Таблица 7 - Влияние степени измельчения сырья
на выход экстракта альфредии поникшей

Примечание: экстрагент — 70 % этанол, соотношение сырье -
экстрагент — 1:20, время экстракции — 90 мин, температура экстракции —
80 °С.

В результате проведенных исследований выявлено, что оптимальными
условиями для экстракции растительного сырья 70 % этанолом являются
степень измельчения сырья 2 мм, соотношение сырье—экстрагент — 1:20,
температура - 80 °С, время экстракции - 90 мин.

При разработке рационального способа получения экстракта альфредии
поникшей на 70 % этаноле, как перспективного ноотропного средства,
применяли также метод противоточной экстракции в батарее из пяти
перколяторов в течение 24 ч [83]. Проведенные фармакологические
испытания показали, что эффекты, оказываемые экстрактами, полученными
разными способами, практически равнозначны (см. Приложение). Однако
выходы экстрактов по отношению к растительному сырью значительно
отличаются и составляют 14,8±0,3 %, при применении метода с
использованием нагревания, и 4,0±0,3 %, в противоположном случае. Время
процесса также различно: 10 суток, в случае применения метода
противоточной экстракции, и всего 3-4 ч - при получении экстракта с
использованием нагревания.

Для установления БАВ, обусловливающих его ноотропную активность,
осуществляли разделение фармакологически активного экстракта на фракции
и исследовали химический состав последних хроматографическими и
спектральными методами (см. главу 2).

Получение экстракта альфредии поникшей, обладающего
выраженными ноотропными свойствами, осуществляли следующим образом:
0,4 кг воздушно-сухой надземной части растения (размер частиц 2-3 мм),
собранной в периоды цветения и начала плодоношения, помещали в
круглодонную колбу вместимостью 5 л и прибавляли 4,8 л 70 % этанола,
колбу присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане
при температуре 80 °С в течение 1 ч. Полученную порцию экстракта после
охлаждения фильтровали и процесс повторяли ещё два раза в указанных
условиях. Извлечения объединяли и упаривали в вакууме при температуре не
выше 60 °С. Таким образом обработали 5 кг растительного сырья альфредии

поникшей и получили вязкую массу коричнево-зеленого цвета (выход 585 г
или 11,7 %). 150 г экстракта растения растворяли в воде (1:4) и
экстрагировали в делительной воронке последовательно хлороформом
(5x150 мл), этилацетатом (4x150 мл) и бутанолом—1, насыщенным водой
(8x250 мл). Полученные фракции упаривали в вакууме при температуре не
выше 60 °С. В результате получили хлороформную, этилацетатную,
бутанольную фракции и водный остаток с выходами 31,4 %, 11,5 %, 10,3 % и
46,8 % от массы экстракта соответственно.

Хлороформная фракция
С помощью хроматографии в тонком слое сорбента и бумажной
хроматографии в хлороформной фракции в сравнении с достоверными
образцами обнаружили пигменты (хлорофилл), стерины ф-ситостерин),
тритерпеновые соединения, гидроксикумарины (эскулетин), ароматические
кислоты (бензойная, салициловая, ванилиновая). Для этого использовали
системы растворителей I, VI, VII, XII, XIII, а в качестве проявляющих
реагентов ванилин - фосфорный реактив, диазореактив, раствор серной
кислоты, фильтрованный УФ - свет с длиной волны 254 нм [148].
С целью детального анализа хлорофомной фракции, ее подвергали
хроматомасс-спектрометрии в системе, включающей газо-жидкостный
хроматограф, соединенный с масс-спектрометрическим детектором (ГХ/МС).
В результате хроматомасс-спектрометрии в хлороформной фракции
обнаружено 35 компонентов, 20 из которых идентифицированы (рис. 2, табл.
8). Обнаруженные вещества относятся к следующим группам БАВ: простые
фенолы (стирол, конифериловый спирт, бензиловый спирт), алканы (1-
фенил-1-циклогексан, пентакозан), ароматические кислоты и их эфиры
(бензойная, салициловая кислоты, этилсалицилат), альдегиды (ванилин,
сиреневый альдегид), ациклические дитерпеноиды (фитол), насыщенные и
ненасыщенные жирные кислоты (пальмитиновая, линолевая, а-линоленовая),
тритерпеновые соединения ((3-амирин, ацетат олеаноловой кислоты).
Значительное содержание в составе хлороформной фракции отмечено для
производных фталевой кислоты (диэтилфталат, моно(2-этилгексил) фталат),
тритерпеновых соединений и пальмитиновой кислоты.

Выделение фенольных и тритерпеновых соединений из
хлороформной фракции осуществляли методом адсорбционной
колоночной хроматографии на силикагеле (L 100/250 Lachema). Для этого
20 г хлороформной фракции вносили в колонку с сорбентом в
соотношении 1:10 (диаметр — 5,5 см, высота - 72 см). Элюирование
осуществляли последовательно хлороформом, смесью хлороформ-этанол
(с увеличением градиента гидрофильности, 98:2—>80:20) и этанолом.
Фракции собирали по 250 мл и упаривали досуха. Контроль за
разделением суммарной фракции осуществляли методом хроматографии в
тонком слое силикагеля в системах растворителей I, V, VI, IX, используя
для обнаружения фенольных соединений фильтрованный УФ - свет,
раствор гидроксида калия, диазореактив и ванилин-фосфорный реактив;
для тритерпеновых соединений и стеринов — ванилин-фосфорный реактив.
Фракции с аналогичной хроматографической картиной объединяли. При
элюировании хлороформом получили фракцию жирного масла, а далее
фракции, содержащие по хроматографическим данным, вещества
тритерпеновой и стериновой природы. С помощью хроматографии в
тонком слое силикагеля и на бумаге во фракции, элюированной в
последующем хлороформом, идентифицировали ванилиновую и коричную
кислоту. При элюировании смесью хлороформ-этанол 93:7—90:10
получили фракцию, в которой согласно хроматографии в тонком слое и на
бумаге, доминируют вещества фенольной природы.
Во фракции, составляющей 30 % от массы хлороформной фракции и
элюированной хлороформом, согласно хроматографическим данным,
обнаружили не менее шести веществ тритерпеновой и стериновой природы.
Для ее разделения использовали рехроматографию: 6 г фракции вносили в
колонку (диаметр - 3 см, высота - 70 см) с силикагелем (L 100/250 Lachema)
55
в соотношении 1:20, элюируя гексаном, смесью гексан-ацетон в различных
соотношениях (98:2—>90:10) и ацетоном. Фракции собирали по 150 мл. При
промывании колонки смесью гексан-ацетон 98:2 получили однородную по
хроматографии в тонком слое смесь веществ 1-4. Во фракции, полученной
системой гексан-ацетон 95:5, по хроматографической подвижности в тонком
слое силикагеля в сравнении с достоверным образцом выявили наличие 0-
ситостерина.
При элюировании смесью хлороформ-этанол 93:7-90:10 получена
фракция, содержащая, по хроматографическим данным, не менее шести
фенольных соединений. С целью очистки от примеси тритерпеновых и
стериновых соединений 3,8 г указанной фракции предварительно
обрабатывали ацетоном. При этом после декантации получили осадок (0,8 г
или 4 % от массы хлороформной фракции), содержащий тритерпеновые и
стериновые соединения, и ацетоновый раствор, который упаривали (3 г или
15 % от массы хлороформной фракции) и подвергали рехроматографии. Для
этого 3 г полученной фракции вносили в колонку (диаметр — 2 см, высота -
72 см) с силикагелем (L 40/100 Lachema) в соотношении 1:25, элюируя
хлороформом, смесью хлороформ-ацетон в различных соотношениях
(98:2—>50:50) и ацетоном. Фракции собирали по 100 мл. При промывании
колонки смесью хлороформ-ацетон 6:4 с последующим противоточным
распределением в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (5:6:4) из
нижней фазы получили индивидуальное вещество 5 - доминирующее во
фракции.
Смесь веществ 1-4 — белый мелкокристаллический порошок, т. пл. 160-
161°С (этанол), растворим в гексане, хлороформе, не растворим в этаноле,
метаноле и воде. УФ-спектр (C6HU), Хт^, нм: 210, (220). ИК-спектр (КВг),
vmax, см"1: 1043, 1072, 1085, 1110, 1138 (ОН), 1189, 1217, 1253, 1273, 1298,
1360, 1381, 1454, 1463 (СН3, СН2, СН), 1641 (С=С), 2660, 2725 (ОН), 2872,
56
2962 (СН3, СН2, СН), 3387, 3614 (ОН). Выход - 1,6 г. На пластинке «Silufol
UV-254» в системах растворителей V и VII имеет одно пятно красно-
фиолетового цвета с Rf 0,70 и 0,45 соответственно.
Разделение указанной смеси явилось сложной экспериментальной
задачей, поэтому для исследования применяли метод хромато-масс-
спектрометрии (ГХ/МС). В результате во фракции идентифицировали р-
амирин (олеан-12-ен-З-ол, 27,48 %, tr 53,58 мин), а-амирин (урс-12-ен-З-ол,
27,52 %, tr 57,72 мин), моретенол (гоп-22(29)-ен-Зр-ол, 25,52 %, tr 66,11 мин)
и лупеол (луп-22(29)-ен-Зр-ол, 19,48 %, tr 66,96 мин).
Вещество 5 - белый порошок, 86 °С (газообразные выделения), 250 °С
(с разложением), растворим в метаноле, этаноле, ацетоне, хлороформе, не
растворим в воде. УФ-спектр, А^ах, н м : 224, 255, 274, 299. ИК-спектр (КВг),
vmax, см"1: 1026, 1074, 1140, 1157, 1194 (ОН), 1235, 1264 (=С-0-С), 1332, 1349,
1383, 1421, 1453, 1464 (СН3, СН2, СН), 1515, 1592, 1606 (С=С), 1766
( о' w) , 2598, 2839, 2866 (ОСН3), 2921, 3014, 3419 (ОН). Выход - ОД г.
На пластинке «Сорбфил ПТСХ-П-А» в системах растворителей хлороформ-
этанол 8:1 и эти л ацетат-этанол 8:1 имеет одно пятно темно-серого цвета с Rf
0,11 и 0,23 соответственно.
ЯМР спектр 13С содержит 27 сигналов, их которых шесть четвертичных
и шесть третичных ароматических, шесть принадлежат молекуле глюкозы
(табл. 9). В молекуле содержится также алифатический компонент,
состоящий из шести углеродных атомов. Три из них принадлежат
метиленовым группам, одна из которых является карбинольной. В
алифатический фрагмент входит также карбонильная группа и два третичных
углеродных атома. Кроме того, в соединении присутствуют три метоксильные
группы.
Химический сдвиг карбонильной группы 178,7 м.д. и полоса
57
поглощения в ИК-спектре 1766 см" предполагает наличие у-лактонного
фрагмента. Анализ одно- и двумерных спектров ЯМР показал, что в веществе
содержатся несвязанные между собой два тризамещенных ароматических
кольца.
Химические сдвиги атомов углерода скоррелированы с сигналами
протонов с использованием метода HSQC (табл. 9). Основные сведения о
химической структуре вещества получены путем анализа двумерных
спектров COSY и НМВС.

Примечание: * - значения взаимозаменяемы. ЯМР lH (DMSO-De, 400
МГц, 5, м.д.) и ЯМР 13С (DMSO-D6, 125,76 МГц, 6, м.д.).
Относительная стереохимия молекулы 5 определена путем анализа
спектров ROESY. 7рд«с-расположение бензилильных заместителей по
отношению к лактонному циклу следует из того, что в этих спектрах ROESY
и NOESY отсутствуют кросс-пики между протонными сигналами групп С6 и
С7. Все остальные кросс-пики, вызванные ядерным эффектом Оверхаузера,
показаны стрелками на рисунке 3. Протоны НЗ; Н4 и Н5ос показывают
взаимодействие с протонами НЗ'; Н6' и НЗ"; Н6' ароматических ядер, что
свидетельствует о свободном вращении циклов по осям С6-СГ и С7-С1".
Рисунок 3 — Формула вещества 5 (1) и кросс-пики, вызванные ядерным
эффектом Оверхаузера (2).
Таким образом, на основании физических, спектральных и
хроматографических характеристик установлена структура вещества 5 — 3-
(3-метокси-4-р-В-глюкопиранозилоксибензил)-4-(3,4-диметоксибензил)-
бутиролактон (арктиин). Полученные данные согласуются с литературными
[180].
Этилацетатная фракция
59
С помощью бумажной хроматографии и хроматографии в тонком слое
сорбента в сравнении с достоверными образцами выявили, что этилацетатная
фракция содержит: простые фенолы, флавоноиды (кверцетин, кемпферол,
таксифолин, апигенин, лютеолин, изокверцитрин, лютеолин-7-глюкозид),
ароматические кислоты (ванилиновая, коричная, кофейная, хлорогеновая),
лигнаны, кумарины, тритерпеновые соединения, стерины (Р-ситостерин) и
неорганические компоненты [11].
В этилацетатной фракции экстракта альфредии, используя двумерную
хроматографию на бумаге марки «FN-4» в системах растворителей бутанол-1-
уксусная кислота-вода (3:1:1) и XV после детекции в фильтрованном УФ-
свете, растворами алюминия хлорида, калия гидроксида и диазореактивом,
установлено наличие не менее 17 фенольных соединений, из которых 10 -
флавоноиды, 6 - фенолкарбоновые кислоты, 1 - кумарин.
Разделение этилацетатной фракции альфредии (15 г) осуществляли
методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле (L 100/250
Lachema) при соотношении 1:7 (диаметр колонки - 5 см, высота - 60 см).
Элюирование проводили последовательно хлороформом, смесью хлороформ-
этанол (с увеличением градиента последнего, 98:2—»80:20) и этанолом.
Фракции собирали по 250 мл. Контроль за разделением суммарной фракции
осуществляли методом хроматографии в тонком слое силикагеля в системах
растворителей этанол I, II, V, VI, VII, IX, X, используя для обнаружения
фенольных соединений фильтрованный УФ-свет, растворы алюминия
хлорида, калия гидроксида, диазореактив и ванилин-фосфорный реактив; для
тритерпеновых соединений и стеринов — ванилин-фосфорный реактив.
Фракции с аналогичной хроматографической картиной объединяли. При
элюировании первыми порциями хлороформа получили фракцию,
содержащую вещества тритерпеновой природы: смесь веществ 1-4, Р-
ситостерин.Во фракции, элюированной хлороформом в последующем,
согласно хроматографии на бумаге и в тонком слое, доминируют
липофильные фенольные соединения. При элюировании смесью хлороформ-
60
этанол 98:2 в индивидуальном состоянии получили вещества 6 и 7,
хлороформ-этанол 88:12 — вещество 8. Также во фракциях, полученных
системой хлороформ-этанол 98:2-95:5, по хроматографической подвижности
в тонком слое и на бумаге в сравнении с достоверными образцами,
содержится сумма агликонов флавонидов, состоящая из апигенина,
лютеолина, кемпферола, кверцетина, таксифолина.Фракции, выделенные
смесью хлороформ-этанол 93:7-90:10, хроматографически с достоверными
образцами показали содержание гликозидов флавоноидов (изокверцитрина,
лютеолин-7-глюкозида).
Согласно хроматографическим данным, во фракции, элюированной
хлороформом, обнаружили не менее шести веществ фенольной природы
липофильного характера, которые разделяли рехроматографией. С этой целью
0,53 г фракции вносили в колонку (диаметр - 0,9 см, высота - 70 см) с
силикагелем (L 100/250 Lachema) в соотношении 1:25, элюируя гексаном,
смесью гексан-ацетон в различных соотношениях (99:1—>80:20) и ацетоном.
Фракции собирали по 30 мл. При промывании колонки смесью гексан-ацетон
92:8 получили вещество 9, гексан-ацетон 80:20 - вещество 10. С помощью
хроматографии в тонком слое силикагеля во фракции, элюированной смесью
гексан-ацетон 84:16, идентифицировали арктиин.
Вещество 6 — желтые кристаллы, т. пл. 312-313°С (этанол-хлороформ
1:20), растворимы в ацетоне, этаноле и метаноле, не растворимы в гексане,
хлороформе и воде. УФ-спектр (С2Н5ОН), ?wc, нм: 255, (295), (317), 372. ИК-
спектр (KBr), vmax, см"1: 1093, 1166, 1201 (ОН), 1513, 1557, 1606 (С6Н6), 1659
(аромат. С=0 у-пиронового цикла), 3280 (ОН). Выход 0,032 г. На пластинке
«Silufol UV-254» в системах растворителей гексан-ацетон (1:1), хлороформ-
этанол (9:1) проявляется в виде пятна с Rf 0,55 и 0,50 соответственно. В УФ
свете — темно-желтое, с раствором алюминия хлорида — ярко-желтое,
диазореактивом - коричневое, ванилин-фосфорным реактивом — лимонно-
желтое окрашивание. По физическим, спектральным и хроматографическим
характеристикам в сравнении с достоверным образцом вещество 6
61
идентифицировали как 3',4',3,5,7-пентагидроксифлавон (кверцетин) (рис. 4).
Рисунок 4 — Формула вещества 6 (кверцетин).
Вещество 7 - белый мелкокристаллический порошок, т. пл. 282-283 °С
(хлороформ-этанол 6:4), умеренно растворим в хлороформе, ацетоне,
этаноле, мало растворим в метаноле, нерастворим в гексане и воде. ИК-
спектр (KBr), vmax, см"1: 1023, 1074, 1105, 1166 (ОН), 1197, 1255, 1304, 1333,
1367, 1379, 1443, 1464 (СН3, СН2, СН), 1644, 1669 (С=С), 2851, 2869, 2934,
2959 (СН3, СН2), 3396 (ОН). Выход 0,016 г. На пластинке «Silufol UV-254» в
системах растворителей IV и хлороформ-этанол (8:1) проявляется в виде
темно-красного пятна при обработке ванилин-фосфорным реактивом с Rf
0,25 и 0,30 соответственно. По физическим и физико-химическим
характеристикам вещество 7 (условное обозначенное ОВ-2)
идентифицировали как тритерпеновое соединение.
Вещество 8 - желтый мелкокристаллический порошок, т. пл. 238-
240 °С (ацетон). УФ-спектр (С2Н5ОН), ?w, нм: 258, (300), 360; (+А1С13+НС1):
268, 410. ИК-спектр (KBr), vmax, см-1: 1001, 1017, 1062, 1068, 1088, 1134
(пиранозное кольцо), 1231, 1295 (С-О-С), 1524, 1559, 1594, 1602 (С6Н6), 1655
(аромат. С=0 у-пиронового цикла), 3263, 3343 (ОН). Выход 0,037 г. На
пластинке «Silufol UV-254» в системе растворителей X, на бумаге
«Ленинградская М» в системе растворителей XV проявляется в виде пятна с
Rf 0,50 и 0,60 соответственно. В УФ свете — темно-желтое, с раствором
алюминия хлорида - ярко-желтое, диазореактивом — коричневое, ванилин-
фосфорным реактивом — лимонно-желтое окрашивание. В продуктах
кислотного гидролиза (5 % H2S04 , 100 °С, 2 ч) методом хроматографии в
62
тонком слое и на бумаге обнаружили кверцетин и D-глюкозу. По физическим,
спектральным и хроматографическим характеристикам в сравнении с
достоверным образцом вещество 8 идентифицировали как 3-0-P-D-
глюкопиранозид кверцетина (изокверцитрин) (рис. 5).
он о ^К чдш
о у
НОч ^А. Дч.
^^ у^ он
он
Рисунок 5 — Формула вещества 8 (изокверцитрин).
Вещество 9 — бесцветные игольчатые кристаллы со специфическим
запахом, т. пл. 121-122°С (ацетон-гексан 1:20), растворимы в ацетоне,
этаноле, мало растворимы в хлороформе, не растворимы в гексане и воде.
УФ-спектр (С2Н5ОН), ?w, нм: 220, 291. Масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 148
(М4^. Выход 0,003 г. На пластинке «Silufol UV-254» в системе растворителей
VII, на бумаге «Ленинградская М» в системе растворителей XIV проявляется
в виде пятна с Rf 0,50 и 0,90 соответственно. В УФ свете - желтое, с
диазореактивом - коричневое окрашивание. Следовательно, на основании
физических и физико-химических данных в сравнении с достоверным
образцом вещество 9 отождествили с циннамоилкарбоновой кислотой
(коричной кислотой) (рис. 6).
Рисунок 6 — Формула вещества 9 (коричная кислота).
Вещество 10 — белый мелкокристаллический порошок, т. пл. 210-212°С
(этанол-хлороформ 1:20), растворим в ацетоне, этаноле, метаноле, мало
63
растворим в хлороформе и воде, не растворим в гексане. УФ-спектр
(С2Н5ОН), ?w, нм: 220, 260, 290. Масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 168 (М4"), 153,
151, 125, 97. 'Н-ЯМР (й?-ацетон),5, м.д.: 7,62 (дд.; 9 и 2 Гц, Н-6), 7,56 (д.; 2 Гц,
Н-2), 6,92 (д.; 9 Гц, Н-5), 3,90 (с; СН30). Выход 0,010 г. На бумаге
«Ленинградская М» в системах растворителей 2 и 5 % растворы уксусной
кислоты вещество проявляется в виде пятна с Rf 0,25 и 0,60 соответственно. В
УФ свете - синее, с раствором алюминия хлорида в УФ свете - фиолетовая
флуоресценция, диазореактивом и ванилин-фосфорным реактивом — ярко-
желтое окрашивание. Таким образом, на основании полученных физических,
хроматографических и спектральных данных в сравнении с достоверным
образцом вещество 10 идентифицировали как З-метокси-4-
гидроксибензойная кислота (ванилиновая кислота)

Бутанольная фракция
С помощью бумажной хроматографии и хроматографии в тонком слое
сорбента установили, что бутанольная фракция содержит простые фенолы,
флавоноиды (изокверцитрин, лютеолин-7-глюкозид, рутин), ароматические
кислоты (ванилиновая, коричная, кофейная, хлорогеновая), тритерпеновые
соединения (следовые количества), аминокислоты и неорганические
компоненты [148].
Используя двумерную хроматографию на бумаге марки «Ленинградская
М» в системах растворителей бутанол-1-уксусная кислота-вода (3:1:1)и15%
уксусная кислота, в исследуемой фракции экстракта альфредии после
детекции в фильтрованном УФ-свете, растворами алюминия хлорида, калия
гидроксида и диазореактивом, установлено наличие не менее 10 фенольных
соединений, из которых 5 — флавоноиды и 5 — фенолкарбоновые кислоты.
64
Предварительное разделение бутанольной фракции (12 г)
осуществляли флэш-хроматографией на колонке (воронка Шотта) с
силикагелем (L 5/40 Lachema) при соотношении 1:6 (диаметр - 5 см, высота -
17 см). Элюирование проводили последовательно хлороформом, смесью
хлороформ-метанол (6:4 и 2:8) и метанолом. Фракции собирали по 0,3 л
(хороформная), 1,0 л (хлороформ-метанол, 6:4 и метанольная), 0,6 л
(хлороформ-метанол, 2:8) и упаривали досуха. Контроль за разделением
суммарной фракции осуществляли методом хроматографии в тонком слое
силикагеля в системах растворителей I, И, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, используя
для обнаружения фенольных соединений фильтрованный УФ-свет, растворы
алюминия хлорида, калия гидроксида, диазореактив и ванилин-фосфорный
реактив; для тритерпеновых соединений — ванилин-фосфорный реактив; для
аминокислот - раствор нингидрина. Фракции с аналогичной
хроматографической картиной объединяли. Элюирование хлороформом
привело к получению фракции, содержащей в следовых количествах
вещества тритерпеновой природы и липофильные ароматические кислоты
(ванилиновая и коричная).Во фракции, полученной смесью хлороформ-
метанол 6:4, согласно хроматографии на бумаге и в тонком слое, доминируют
гликозиды флавоноидов. При элюировании смесью хлороформ-метанол 2:8
получили вещество 11 и, кроме того, во фракции идентифицировали
кофейную кислоту. Превалирующими в метанольной фракции явились
аминокислоты (валин, треонин, триптофан, метионин) и неорганические
компоненты.
Во фракции, элюированной смесью хлороформ-метанол 6:4, по
хроматографическим данным, присутствует не менее пяти гликозидов
флавоноидов. Для разделения указанных веществ применяли
рехроматографию: 3,0 г фракции вносили в колонку (диаметр — 2 см, высота —
70 см) с полиамидом (Woelm, Германия) в соотношении 1:10, элюируя водой
и водным этанолом (с увеличением содержания последнего 2,5—> 10 %).
Фракции собирали по 50 мл. При промывании колонки смесью вода-этанол
65
97,5:2,5 получили вещество 12, вода-этанол 95:5 - вещество 8. Также во
фракции, полученной системой вода-этанол 95:5, по хроматографической
подвижности в тонком слое и на бумаге в сравнении с достоверными
образцами, идентифицировали изокверцитрин и лютеолин-7-глюкозид.
Вещество 11 — белый кристаллический порошок, т. пл. 203-204°С
(этанол-вода 3:2), растворим в этаноле, метаноле, воде, частично растворим в
ацетоне, не растворим в хлороформе. УФ-спектр (С2Н5ОН), Хщ^, нм: 243,
(299), 326. ИК-спектр (КВг), vmax, см"1: 1523, 1605 (С6Н6), 1692 (С=0 ел. эф.),
1708 (СООН), 3440, 3476 (ОН). ЯМР спектр !Н (DMCO-d6), 5, м.д.; J, Гц: 7,03
(д., 2,0 Гц, 1Н, Н-2), 6,75 (д., 8,3 Гц, 1Н, Н-5), 6,90 (дд., 8,3 и 2,0 Гц, Ш, Н-6),
6,23 (д., 15,9 Гц, Ш, Н-7), 7,55 (д., 16 Гц, Ш, Н-8); 1,97 (д., 5,3 Гц, 2Н, Н-2'),
5,06 (м., 1Н, Н-3'), 3,9-4,9 (м., 2Н, Н-4* и Н-5'), 1,78 (дд., 12,9 и 7,4 Гц, Ш, Н-
6'акс), 1,97 (дд., 12,9 и 3,0 Гц, 1Н, Н-6'экв.). Масс-спектр, m/z, ЭУ, 70 eV: 355
(М4"). Выход 0,015 г. На пластинке «Sorbfil ПТСХ-П-А» в системе
растворителей этилацетат-муравьиная кислота-вода (8:1:1) и бумаге марки
«Ленинградская М» в 2 %-ной уксусной кислоте вещество проявляется в виде
пятна с Rf 0,70 и 0,51 соответственно. В УФ-свете — голубое пятно, с
диазореактивом - желтое окрашивание. В продуктах щелочного гидролиза
(5 % водный раствор калия гидроксида, 100°С, 2 ч) методом хроматографии в
тонком слое и на бумаге обнаружили кофейную и D-хинную кислоты. На
основании физических, спектральных и хроматографических данных в
сравнении с достоверным образцом полученное вещество 11 является 3-
кофеил-О-хинной кислотой (хлорогеновой кислотой) (рис. 8).
Рисунок 8 - Формула вещества 11 (хлорогеновая кислота).
Вещество 12 — желтые кристаллы, т. пл. 192-194°С (вода), растворим в этаноле, метаноле, нерастворим в гексане и хлороформе. УФ-спектр
(С2Н5ОН), ?w, нм: 258, (299), 363; (+А1С13+НС1): 268, 403. ИК-спектр (КВг),
Vmax, см"1: 1002, 1015, 1043, 1063, 1092, 1123, 1133 (пиранозное кольцо), 1235
(С-О-С), 1504, 1557, 1574, 1599 (С6Н6), 1656 (аромат. С=0 у-пиронового
цикла), 3422 (ОН). Выход 0,1 г. На пластинке «Sorbfil ПТСХ-П-А» в системе
растворителей XI и бумаге марки «Ленинградская М» в системе XIV
вещество проявляется в виде пятна с Rf 0,50 и 0,55 соответственно. В УФ
свете — темно-желтое, с раствором алюминия хлорида — ярко-желтое,
диазореактивом - коричневое, ванилин-фосфорным реактивом - лимонно-
желтое окрашивание. Кислотный гидролиз (5 % H2S04 , 100 °С, 2 ч) показал
наличие кверцетина, D-глюкозы и L-рамнозы. По физическим, спектральным
и хроматографическим характеристикам в сравнении с достоверным
образцом вещество 12 идентифицировали как З-О-Р-О-глюкопиранозил-
(6—>1)-а-Ь-рамнопиранозид кверцетина (рутин) (рис. 9).
Рисунок 9 — Формула вещества 12 (рутин).
Водный остаток
С помощью бумажной хроматографии и хроматографии в тонком слое
сорбента в сравнении с достоверными образцами установили, что водный
остаток содержит углеводы, 10,63 % азотсодержащих веществ (амины и
аминокислоты) и фенольные соединения (следовые количества). Кроме того,
обнаружены неорганические вещества [148].
67
Обнаружение аминокислот, проведенное на аминокислотном
анализаторе, показало наличие 15 соединений (рис. 10, табл. 10).
Общее содержание аминокислот в водном остатке 70 % экстракта
растения составляет 1,99 % (в т.ч. 0,77 % - незаменимые). В преобладающей
концентрации во фракции экстракта альфредии присутствуют глутаминовая
и аспарагиновая кислоты, пролин, валин, аланин и гистидин.
Относит,
интенсивность
. ,,/VS-v UUi ,,.JP г Г Т ' 1 I i 1 I 1
1
(Д-
1 1 1 1 1
"'"' I1 I ' I I I I I I I I ) . ' I 1 I I I I I I ' I I
10 20 30 40 50 60
t, МИН


Проведенное исседование показало, что водный остаток экстракта
альфредии поникшей на 70 % этаноле содержит 32 % углеводов,
моносахаридный состав которых представлен D-глюкозой, D-галактозой, L-
арабинозой и D-глюкуроновой кислотой.
Исследования элементного состава водного остатка, проведенные
методом плазменной масс-спектрометрии, выявили наличие 43 элементов, 11
из которых являются микроэлементами и 27 ультрамикроэлементами. Среди
обнаруженных элементов 21 - эссенциальные или условно эссенциальные.
На основании полученных данных составлен ряд предпочтительного
накопления элементов: К> Mg> Zn> Rb> Р> Са> Mn> Bi> Hg> Ti> Мо> Ni>
Al> В> Na> Cu> Sr> Ba> Li> Fe> Au> Sn> Os> Cr> Sb> Co> V> Se> Cd> Zr>
Cs> Sc> Ga> As> Ce> W> La> Y> Nd> Re> In> Dy> U, который показывает,
что в преобладающей концентрации в водном остатке обнаружен калий, в
значительных количествах - магний, цинк и рубидий (табл. 11). Далее
следует группа элементов, содержащихся в меньших количествах: фосфор,
кальций, марганец, висмут, ртуть, титан и др. В гораздо меньших
концентрациях присутствуют литий, железо, золото, олово, осмий и др. На
пределе обнаружения зафиксировано наличие кадмия, циркония, цезия,
скандия, галлия, мышьяка и т.д., не обнаружены гафний, германий, ниобий,
палладий и свинец.
Обнаруженная сумма элементов водного остатка, вероятно, может
участвовать в процессах нервной и сосудистой регуляции различных
функций организма, способности потенцировать эффект других БАВ. Так,
железо, цинк и медь способствуют снижению реакции на стрессор в стадии
тревоги, входят в состав ферментов антиоксидантной защиты клеток,
оказывают влияние на течение основных нервных процессов в коре больших
полушарий головного мозга. Калий и рубидий активируют
пируватфосфокиназу, альдегиддегидрогеназу и другие ферменты,
способствуют насыщению крови кислородом. Магний — обязательный
69
участник синтеза всех неиропептидов в головном мозге, он входит в состав
13 металлопротеинов и более 300 ферментов [121, 146].




Выводы по 4 главе:
1. Разработан способ получения фармакологически наиболее активного
экстракта: экстракцию следует проводить 70 % этанолом в соотношении
1:20—1:25 при температуре 80-90 °С и степени измельчения сырья — 2 мм в
течение 90-120 мин.
2. Установлен химический состав фармакологически активного
экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле. Обнаружены простые
фенолы (стирол, бензиловый спирт, конифериловый спирт),
гидроксикумарины (экскулетин), стерины (р-ситостерин), различные
представители группы флавоноидов (кверцетин и его гликозиды, кемпферол,
таксифолин, апигенин, лютеолин, лютеолин-7-глюкозид) и тритерпеновых
веществ (а-амирин, Р-амирин и его ацетат, моретенол, лупеол), лигнаны
(арктиин), ароматические кислоты и их эфиры (бензойная, салициловая и ее
этиловый эфир, ванилиновая, коричная, кофейная, хлорогеновая),
аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая кислоты, пролин, валин,
аланин, гистидин и др.), макро- и микроэлементы.
3. Биологически активные вещества распределены по фракциям
экстракта альфредии поникшей следующим образом: основное количество
флавоноидов концентрируется в этилацетатной и бутанольной фракциях;
лигнаны, кумарины обнаружены в хлороформной и этилацетатной фракциях;
простые фенолы, органические кислоты и тритерпеновые соединения — в
хлороформной, этилацетатной и бутанольной фракциях; азотсодержащие
соединения (амины, аминокислоты), макро- и микроэлементы (калий,
магний, цинк, рубидий, фосфор, кальций, марганец, висмут, ртуть, титан и
др.) преобладают в бутанольной фракции и водном остатке.
4. В результате химического исследования из активных фракций
экстракта альфредии выделены лигнан (арктиин), флавоноиды (кверцетин,
изокверцитрин, рутин), ароматические кислоты (коричная, ванилиновая и
хлорогеновая) и тритерпеновые спирты (а-амирин, Р-амирин и его ацетат,
моретенол, лупеол).
Глава 5. Разработка нормативной документации на лекарственное
растительное сырье и жидкий экстракт альфредии поникшей
Стандартизацию травы альфредии поникшей, жидкого экстракта и
разработку ФС проводили в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00 и ГФ XI.

5.1. Стандартизация травы альфредии поникшей
В качестве сырья использовали траву альфредии поникшей
(олиственную верхнюю часть растения и прикорневые листья).
Производящим растением является альфредия поникшая {Alfredia cernua (L.)
Cass.) сем. сложноцветные (Asteraceae).
Для стандартизации травы альфредии поникшей проводили
исследование образцов растения, собранных в фазу цветения (июль - август):
1. Республика Хакасия, Ширинский р-н, вдоль реки Инжуя; 2001 г.
2. Алтайский край, Солонешенский р-н, долина реки Ануй; 2005 г.
3. Республика Горный Алтай, Шебалинский р-н, окр. п. Шебалино;
2005 г.
4. Республика Горный Алтай, Усть-Канский р-н, окр. перевала
Ябочанский; 2005 г.
5. Республика Горный Алтай, Усть-Канский р-н, окр. перевала
Ябочанский; 2006 г.
6. Сибирский ботанический сад Томского государственного
университета; 2006 г.
7. Сибирский ботанический сад Томского государственного
университета; 2007 г.
5.1.1. Определение морфолого-анатомических признаков травы
альфредии поникшей
Внешние признаки цельного сырья
Смесь олиственных стеблей, листьев, цветков. Нижние листья
длинночерешковые, верхние — сидячие, сердцевидно-яйцевидной формы,
заостренные, по краям выемчато-зубчатые; сверху голые, зеленые, снизу
бело-войлочные. Стебли прямые, вверху сильно ветвистые, слегка
паутинистые, полые диаметром не более 20 мм. Цвет стеблей грязно-
пурпуровый снаружи и белый внутри. Корзинки многочисленные на
верхушке ветвей, поникшие, диаметром 4-5 см. Листочки обертки линейные
с широким перепончатым светло-желтым зазубренным придатком. Венчик
желтый, трубчатый, в верхней части имеет пять долей.
Внешние признаки измельченного сырья
Кусочки стеблей, листьев и цветков, проходящих сквозь сито с
отверстиями диаметром 7 мм. Запах специфический. Вкус водного
извлечения горьковатый.
Микроскопические признаки сырья
При рассмотрении листа с поверхности видны сильно извилистые
звездчатые или амебовидные клетки верхнего эпидермиса (рис. 11). По краю
листа они вытянуты и имеют удл1«ненно-трапециевидную форму со
скошенными перегородками. Волоски редкие двух типов: простые
многоклеточные тонкостенные и простые многоклеточные толстостенные с
продольной складчатостью, расширенные при основании и постепенно
суженные кверху.
Эпидермис нижней стороны листа (рис. 12) состоит из более мелких
клеток, имеющих сильно извилистое очертание. Устьица многочисленные,
полупогруженные, окружены 5-6 клетками. Нижняя сторона листа обильно
опушена простыми волосками с основанием из 5-6 коротких клеток и
длинной тонкостенной конечной клеткой. Встречаются простые
многоклеточные тонкостенные волоски, расположенные большей частью по
жилкам.

Наружный эпидермис лепестка венчика (рис. 13) состоит из
удлиненных бочонковидных клеток с тонкими, ровными стенками. По краям
лопастей венчика клетки наружного эпидермиса имеют ромбическую или
квадратную форму. Клетки верхней (внутренней) стороны венчика
удлиненные с малоизвилистыми стенками, волоски простые многоклеточные
тонкостенные и звездчато-лучистые .многоклеточные с основанием из 3-5
удлиненных клеток. При рассмотрении листочков обертки видны
извилистостенные удлиненные клетки эпидермиса.
Стебель на поперечном срезе (рис. 14) ребристый. Пучки открытые
коллатеральные с хорошо развитым многорядным слоем флоэмы и ксилемы.
Пучки окружены толстостенными клетками склеренхимы. При рассмотрении
стебля с поверхности видны клетки эпидермиса с тонкими стенками. Устьица
немногочисленные, окружены 4-5 клетками. На эпидермисе стебля часто
встречаются простые многоклеточные волоски с неравномерными
утолщениями и простые многоклеточные двухрядные волоски.
Таким образом, в результате изучения анатомического строения
надземной части альфредии поникшей установлено, что диагностическими
признаками растения является наличие различных типов волосков. На
эпидермисе листа расположены простые многоклеточные тонкостенные и
толстостенные волоски с продольной складчатостью и простые тонкостенные
волоски с многоклеточным основанием. Простые многоклеточные
тонкостенные и звездчато-лучистые многоклеточные волоски с
многоклеточным основанием следует отнести к диагностическим признакам
цветка. На эпидермисе стебля встречаются простые многоклеточные волоски
с неравномерными утолщениями и простые многоклеточные двухрядные
волоски [7].


5.1.2. Разработка методик качественного обнаружения и
количественного определения флавоноидов в траве альфредии
поникшей

Качественное обнаружение и количественное определение
действующих веществ в траве альфредии поникшей предложено проводить
по флавоноиду изокверцитрину - доминирующему веществу, обладающему
ноотропными свойствами (см. главу 4, Приложение).
Для идентификации флавоноидов применяли хроматографию в
тонком слое силикагеля - метод, позволяющий разделить сумму БАВ
экстракта, характеризующийся чувствительностью и экспрессностью.
Обнаружение проводили на пластинках «Сорбфил ПТСХ-П-А» в
экспериментально подобранной системе растворителей этилацетат —
муравьиная кислота - вода (8:1:1), в которой достигается наилучшее
разделение флавоноидов экстракта альфредии поникшей. В качестве
детектора использовали фильтрованный УФ-свет с длиной волны 254 нм и
5 % раствор алюминия хлорида на 70 % этаноле. Указанный реактив
чувствителен и образует с флавоноидами комплексы характерного желтого
цвета.
Методика. 5 мл раствора А (см. раздел «Количественное
определение»), высушивают в выпарительной чашке на водяной бане при
температуре не более 50 °С досуха. Полученный сухой остаток растворяют в
1 мл 70 % спирта этилового. На линию старта хроматографической
пластинки «Сорбфил ПТСХ-П-А» размером 10x5 см в виде точки наносят
0,03 мл полученного раствора. Пластинку сушат при комнатной температуре
в течение 5 мин, затем помещают в камеру со смесью растворителей
этил ацетат-муравьиная кислота-вода 8:1:1 и хроматографируют восходящим
методом. Когда фронт растворителей пройдет до конца пластинки, пластинку
вынимают из камеры, сушат при комнатной температуре в течение 5 мин и
просматривают в УФ-свете при длине волны 360 нм. На хроматограмме
80
должна обнаруживаться зона адсорбции темно-желтого цвета с Rf около 0,50
(изокверцитрин). Затем хроматограмму опрыскивают 5 % раствором
алюминия хлорида в 70 % спирте этиловом и нагревают в сушильном шкафу
5-10 мин при температуре 100-105 °С. При этом указанная зона должна
приобретать ярко-желтый цвет в видимом и УФ-свете при длине волны
360 нм. На хроматограмме испытуемого раствора, кроме основной зоны
адсорбции, допускается наличие дополнительных зон адсорбции, в том числе
желтого цвета с Rf около 0,30 и 0,90 (рутин и кверцетин соответственно),
зеленого цвета с Rf около 0,70 и 0,80 (хлорогеновая и кофейная кислоты
соответственно).
Примечание. Приготовление 5 % раствора алюминия хлорида в 70 %
спирте этиловом. 5,0 г алюминия хлорида (ГОСТ 3759-75, чда) помещают в
мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 % спирте этиловом и
доводят объем раствора тем же растворителем до метки, перемешивают.
Срок хранения - 3 месяца.
Для количественного определения флавоноидов использовали метод
дифференциальной спектрофотометрии [49]. В связи с отсутствием
выраженного максимума поглощения в УФ-спектре и для увеличения
избирательности методики, определяли оптическую плотность окрашенных,
устойчивых во времени продуктов реакции флавоноидов альфредии
поникшей с алюминия хлоридом. Спектры поглощения (рис. 15) продуктов
реакции изокверцитрина с алюминия хлоридом и флавоноидов альфредии с
указанным реактивом совпадают (7^^ 410±2 нм), поэтому определяли
содержание флавоноидов в пересчете на доминирующий, обладающий
ноотропной активностью флавоноидный гликозид, — изокверцитрин.
При образовании комплекса изокверцитрина с алюминия хлоридом,
наблюдали батохромный сдвиг первого максимума с 258±2 на 268±2 нм,
второго - с 360±2 на 410±2 нм.
81
D0,7
360 370 380 390 400 410 420 430 440
X, нм
Рисунок 15 - Спектры поглощения в видимой области комплексов
изокверцитрина (1) и флавоноидов экстракта из травы альфредии поникшей
на 70 % этаноле (2) с алюминия хлоридом. По оси абсцисс - длина
волны, нм. По оси ординат — оптическая плотность.
В ходе эксперимента определяли оптимальные условия реакции
комплексообразования изокверцитрина с алюминия хлоридом. Установлено,
что для проведения реакции необходимо использовать 18 мл 10% раствора
алюминия хлорида (1,80 г), время реакции - 30 мин (табл. 13-14).

Примечание: экстрагент — спирт этиловый 70 %, степень измельчения
сырья — 2 мм, соотношение сырье — экстрагент — 1:24, кратность экстракции —
2 раза, время реакции - 30 мин.

В результате установлено, что оптимальным экстрагентом является
70 % этанол, наибольший выход флавоноидов наблюдается при степени
измельчения травы 2 мм, т.к. при большем или меньшем измельчении
снижается выход веществ (табл. 16-17). Наиболее значимым фактором
экстракции является соотношение сырье-экстрагент, оптимальное значение —
1:24 (табл. 18). При уменьшении количества экстрагента снижается выход
флавоноидов, а дальнейшее увеличение не рационально, т.к. не приводит к
значительному повышению выхода. Рациональной является двукратная
экстракция (табл. 19). При однократном экстрагировании выход меньше, чем
при двукратном, а обработка травы третьей порцией экстрагента не приводит
к значительному увеличению выхода флавоноидов. Экстракцию
растительного сырья следует осуществлять при температуре 80 °С (табл. 20),
т.к. понижение температуры способствует снижению выхода флавоноидов за
счет уменьшения их растворимости, а повышение температуры также влечет
за собой снижение выхода веществ, вероятно, вследствие изменения их
нативности. Наиболее оптимальным временем экстракции является 30 мин
(табл. 21). В случае уменьшения продолжительности процесса происходит
снижение выхода флавоноидов за счет уменьшения времени контакта сырье-
экстрагент, а дальнейшее увеличение не рационально, т.к. выход веществ не
повышается.
Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до величины
частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм. Около 1,0 г
(точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу вместимостью
100 мл, прибавляют 24 мл 70 % спирта этилового, присоединяют к обратному
холодильнику и нагревают на водяной бане на электрической плитке в
течение 30 мин.
Затем колбу охлаждают до комнатной температуры и фильтруют
содержимое в мерную колбу вместимостью 100 мл через бумажный фильтр.
Экстракцию повторяют ещё раз в вышеуказанных условиях, полученное
извлечение фильтруют в ту же мерную колбу. Отработанное сырье помещают
87
на фильтр и промывают 10 мл 70 % спирта этилового. Объем охлажденного
фильтрата доводят 70 % спиртом этиловым до метки (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 6 мл раствора А,
прибавляют 18 мл 10 % раствора алюминия хлорида в 70 % спирте этиловом,
доводят объем раствора до метки и перемешивают (раствор Б).
Измеряют оптическую плотность полученного раствора на
спектрофотометре при длине волны 410±2 нм в кювете с толщиной слоя
10 мм, используя в качестве раствора сравнения следующий: в мерную колбу
вместимостью 25 мл помещают 6 мл раствора А и доводят до метки 70 %
спиртом этиловым.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на изокверцитрин и
абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
Д-100-25-100 _Р-141,24
" 295-m-6-(\00-W)~ (lOO-JT)' Г Д 6
D - оптическая плотность исследуемого раствора;
295 - экспериментально установленный удельный показатель
поглощения изокверцитрина по реакции с алюминия хлоридом при длине
волны 410±2 нм;
m — точная навеска сырья, г;
W - потеря в массе при высушивании, %;
6 - аликвота, мл;
25, 100 -разведение, мл.
Примечание. Приготовление 10 % раствора алюминия хлорида в
70% спирте этиловом. 10,0 г алюминия хлорида (ГОСТ 3759-75, ЧДА)
помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 % спирте
этиловом и доводят объем раствора тем же растворителем до метки,
перемешивают. Срок хранения - 3 месяца.
Результаты количественного анализа исследуемого образца травы
альфредии поникшей представлены в таблице 22. Относительная ошибка
методики составляет 5,6 % (табл. 23).

В результате исследования установлено, что количественное
содержание флавоноидов в траве альфредии поникшей, собранной в
различных районах Республики Хакасия, Горный Алтай, Алтайского края и
на экспериментальной базе Сибирского ботанического сада, варьирует от
0,58 до 1,0 % (табл. 24).
Валидационную оценку разработанной методики количественного
определения флавоноидов проводили по показателям линейность,
прецизионность (воспроизводимость) и точность.
Для подтверждения линейности предлагаемой методики строили
градуировочный график зависимости оптической плотности продукта
реакции флавоноидов из травы альфредии поникшей с раствором алюминия
хлорида от их содержания (рис. 17, табл. 25) и рассчитывали свободный член
линейной зависимости (а), угловой коэффициент линейной зависимости (Ь) и
коэффициент корреляции (R2).


В результате установлено, что в данной области концентраций
флавоноидов в траве альфредии поникшей (0,3 до 1,3 %) график имеет
линейный характер и описывается уравнением у=0,6313х+0,0065.
Коэффициент корреляции равен 0,9998, что позволяет использовать данную
методику для количественного определения флавоноидов в траве альфредии
поникшей в данном диапазоне концентраций.
Для установления прецизионности (воспроизводимости) проводили 7
параллельных определений, затем вычисляли величину стандартного
отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 26).


В ходе эксперимента установлено, что в разработанной методике
величина относительного стандартного отклонения менее 1 %, что
характеризует надежность анализа в выбранных условиях.
Для определения точности методики проанализировали 9 образцов
травы на 3 уровнях концентраций в пределах аналитической области. Для
оценки полученных результатов использовали открываемость (R). В
результате получены 9 значений открываемости, для которых вычисляли
величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного
отклонения (RSD) (табл. 27).


Полученные результаты показывают, что разработанная методика
обеспечивает необходимую точность полученных результатов, что
предполагает ее использование в качестве оптимальной для количественного
определения флавоноидов в траве альфредии поникшей.
5.1.3. Определение динамики накопления флавоноидов в траве
альфредии поникшей
Исследования содержания флавоноидов в траве альфредии поникшей в
различные фазы развития показали, что оно достигает максимума в период
цветения — 0,58 %, несколько ниже в фазу вегетации — 0,41 %, а минимальное
количество флавоноидов накапливается в фазу бутонизации и плодоношения
- 0,32 % (табл. 28).
В результате изучения содержания флавоноидов в различных органах
цветущего растения установили, что наибольшее их количество
накапливается в цветках альфредии поникшей - 1,11 %. В листьях растения
содержание данной группы веществ ниже - 0,76 %. Минимальное количество
флавоноидов в стеблях альфредии поникшей — 0,07 % (табл. 30).


Накопление значительного количества флавоноидов в фазу вегетации,
возможно, связано с особенностью развития растения: в данный период у
альфредии присутствуют только прикорневые листья. В процессе развития
растения происходит образование цветоносного стебля с постепенным
отмиранием прикорневых и развитием стеблевых листьев (табл. 29).
Учитывая морфологическое строение растения, его высоту и места
произрастания, можно предположить, что полый и деревянистый стебель
служит для транспортировки веществ и обеспечивает устойчивость
высокорослого (1,5-3,0 м) растения, не аккумулируя веществ, но давая
прирост биомассы, что отражается в уменьшении количества фенольных
соединений при развитии растения. Увеличение содержания флавоноидов в
период цветения связано с развитием цветков, что подтверждают данные
исследования органов альфредии поникшей.


5.1.4. Определение товароведческих показателей травы альфредии
поникшей
Содержание флавоноидов и экстрактивных веществ устанавливали
извлечением их из измельченной травы альфредии поникшей 70 % этанолом,
учитывая наибольшую фармакологическую активность данного экстракта.
Содержание флавоноидов колебалось в пределах от 0,58 до 1 %, содержание
экстрактивных веществ, извлекаемых 70 % этанолом - от 15,41 до 21,15 %.
Учитывая возможность варьирования данных показателей в зависимости от
места и года сбора образца, целесообразным явилось установить следующие
нормы: содержание флавоноидов — не менее 0,5 %, экстрактивных веществ,
извлекаемых 70 % этанолом, не менее 14 % (табл. 30).
Сушку сырья рекомендуется проводить в хорошо проветриваемых
помещениях. Влажность воздушно-сухого сырья колебалась в пределах от
8,33 до 11,67 %, поэтому предлагаем установить норму по данному
показателю не более 13 % (табл. 30).
Содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10 % растворе
хлористоводородной кислоты, колебалось от 5,63 до 10,00% и от 0,15 до
0,19% соответственно. Исходя из полученных результатов, предлагаем
93
установить пределы указанных показателей не более 13 % и не более 1 %
соответственно (табл. 30).
Принимая во внимание морфологические особенности растения, в
проект ФС заложен показатель толщины стебля. Норму для этого показателя
предлагаем установить не более 20 мм (табл. 30).
Содержание органической (части других растений) и минеральной
примеси колебалось от 0 до 0,71 % и от 0 до 0,41 % соответственно.
Предлагаем ограничить предел этих примесей не более 1,5 % и не более 1 %
соответственно (табл. 30).
Данные ситового анализа показали, что наибольшая часть
измельченного сырья проходит сквозь сито с диаметром отверстий 1-5 мм,
что соответствует необходимой степени измельчения, обеспечивающей
наиболее полное извлечение БАВ. Поэтому предлагаем ограничить
следующие пределы: по показателю для измельченного сырья «содержание
частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм» не более
10 %, «содержание частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий
0,25 мм» не более 10 % (табл. 30).
Таблица 30 - Нормы качества цельной и измельченной
травы альфредии поникшей
Показатель
Содержание флавоноидов, в пересчете
на изокверцитрин
Экстрактивные вещества, извлекаемые 70 %
спиртом этиловым
Влажность
Зола общая
Зола, нерастворимая в хлористоводородной
кислоте
Стебли диаметром более 20 мм
Органическая примесь
Минеральная примесь
Частиц, не проходящих сквозь сито с
диаметром отверстий 7 мм
Частиц, проходящих сквозь сито с
диаметром отверстий 0,25 мм
Микробиологическая чистота


Хранение. В сухом, защищенном от света месте. Для установления
срока годности травы альфредии поникшей средние пробы от семи партий
сырья упаковывали в бумажные пакеты и хранили в темных сухих
помещениях при температуре от +24 °С до -24 °С. Через каждые 6 месяцев
проводили количественное определение действующих веществ
(флавоноидов) и товароведческих показателей. Исследуемые образцы
сохранили доброкачественность за весь период хранения. На основании
полученных данных (табл. 24) сделали заключение о возможности хранения
сырья в течение двух с половиной лет (время наблюдения).
5.2. Стандартизация жидкого экстракта альфредии поникшей
Жидкий экстракт альфредии поникшей получали методом
противоточной экстракции (реперколяция в модификации по Н. А. Чулкову) в
батарее из пяти перколяторов в соотношении растительное сырье — экстракт
1:1 [83] с использованием 70 % спирта этилового в качестве экстрагента.
Выбор данного метода обусловлен его широким применением в
фармацевтической промышленности, в отличие от метода с использованием
нагревания.
Жидкий экстракт альфредии поникший представляет собой жидкость
темно-коричневого цвета с зеленоватым оттенком со специфическим запахом
горько-кислого вкуса.
При разработке методик качественного обнаружения и
количественного определения действующих веществ в жидком экстракте
альфредии поникшей учитывали принцип унификации методик в ряду:
сырье-лекарственная форма, поэтому объем жидкого экстракта для анализа
составляет 1 мл, что соответствует 1 г травы альфредии поникшей.
Определение наличия флавоноидов (изокверцитрин) в жидком
экстракте альфредии проводили методом хроматографии в тонком слое.
Методика. На линию старта хроматографической пластинки «Сорбфил
ПТСХ-П-А» размером 10x5 см в виде точки наносят 0,02 мл жидкого
экстракта. Пластинку сушат при комнатной температуре в течение 5 мин,
затем помещают в камеру со смесью растворителей этилацетат-муравьиная
95
кислота-вода 8:1:1 и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт
растворителей пройдет до конца пластинки, пластинку вынимают из камеры,
сушат при комнатной температуре в течение 5 мин и просматривают в УФ-
свете при длине волны 360 нм. На хроматограмме должна обнаруживаться
зона адсорбции темно-желтого цвета с Rf около 0,50 (изокверцитрин). Затем
хроматограмму опрыскивают 5 % раствором алюминия хлорида в 70 %
спирте этиловом и нагревают в сушильном шкафу 5-10 мин при температуре
100-105 °С. При этом указанная зона должна приобретать ярко-желтый цвет в
видимом и УФ-свете при длине волны 360 нм. На хроматограмме
испытуемого раствора, кроме основной зоны адсорбции, допускается
наличие дополнительных зон адсорбции, в том числе желтого цвета с Rf
около 0,30 и 0,90 (рутин и кверцетин соответственно), зеленого цвета с Rf
около 0,70 и 0,80 (хлорогеновая и кофейная кислоты соответственно).
Количественное определение флавоноидов осуществляли методом
дифференциальной спектрофотометрии, используя реакцию образования
комплекса флавоноидов с раствором алюминия хлорида.
Методика. 1 мл жидкого экстракта помещают в мерную колбу
вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки 70 % спиртом
этиловым (раствор А).
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 6 мл раствора А,
прибавляют 18 мл 10 % раствора алюминия хлорида в 70 % спирте этиловом,
доводят объем раствора до метки и перемешивают (раствор Б).
Измеряют оптическую плотность полученного раствора на
спектрофотометре при длине волны 410±2 нм в кювете с толщиной слоя
10 мм, используя в качестве раствора сравнения следующий: в мерную колбу
вместимостью 25 мл помещают 6 мл раствора А и доводят до метки 70 %
спиртом этиловым.
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на изокверцитрин в
процентах (X) вычисляли по формуле:
£>• 100 -25_£>-1,412
295-я-6~ а 'Г Д6
96
D - оптическая плотность исследуемого раствора;
295 — удельный показатель поглощения изокверцитрина по реакции с
алюминия хлоридом при длине волны 410±2 нм;
а - количество жидкого экстракта альфредии поникшей, мл;
25,100-разведение.
Результаты количественного анализа жидкого экстракта альфредии
поникшей показали, что содержание суммы флавоноидов составляет
0,71±0,03 % (табл. 31). Относительная ошибка методики составляет 4,94 %
(табл. 32).


В результате установлено, что в данной области концентраций
флавоноидов в жидком экстракте альфредии поникшей (0,3 до 1,3 %) график
имеет линейный характер и описывается уравнением у=0,0,7197х-Ю,0097.
Коэффициент корреляции равен 0,9987, что позволяет использовать данную
методику для количественного определения флавоноидов в жидком экстракте
альфредии поникшей в данном диапазоне кошдентраций.
Для установления прецизионности (воспроизводимости) проводили 7
параллельных определений, затем вычисляли величину стандартного
отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD) (табл. 34).


В ходе эксперимента установлено, что в разработанной методике
величина относительного стандартного отклонения менее 1 %, что
характеризует надежность анализа в выбранных условиях.
Для определения точности методики проанализировали 9 образцов
жидкого экстракга на 3 уровнях концентраций в пределах аналитической
области. Для оценки полученных результатов использовали открываемость
(R). В результате получены 9 значений открываемости, для которых
вычисляли величину стандартного отклонения (SD) и относительного
стандартного отклонения (RSD) (табл. 35).


Полученные результаты показывают, что разработанная методика
обеспечивает необходимую точность полученных результатов, что
предполагает ее использование в качестве оптимальной для количественного
определения флавоноидов в жидком экстракте альфредии поникшей.
Содержание флавоноидов в образцах жидкого экстракта альфредии
изменялось в пределах от 0,69 до 0,76 % (табл. 36), поэтому целесообразным
явилось нормировать показатель не менее 0,5 % (табл. 37).
Содержание спирта в жидком экстракте колебалось от 59,5 до 64,6 %,
поэтому предлагаем установить норму по показателю не менее 57 %.
Сухой остаток жидкого экстракта варьирует в пределах от 7,2 до 7,5 %.
Исходя из полученных результатов, предлагаем ограничить содержание
сухого остатка для экстракта не менее 6 %.
Содержание тяжелых металлов в образцах экстракта составляло не
более 0,01 %, поэтому предлагаем ограничить предел содержания тяжелых
металлов не более 0,01 %.


Хранение. В прохладном, защищенном от света месте. Для
установления срока годности жидкого экстракта альфредии, пробы от трех
100
серий хранили в стеклянных флаконах темного стекла, укупоренных
полиэтиленовыми и, сверху, пластмассовыми пробками, при температуре от
+5°С до +25°С. Через каждые 6 месяцев проводили количественное
определение действующих веществ (флавоноидов) и других показателей
качества. Исследуемые образцы сохранили доброкачественность за весь
период хранения. На основашш полученных данных (табл. 36) сделали
заключение о возможности хранения экстракта жидкого в течение трех лет
(время наблюдения). В процессе хранения жидкого экстракта возможно
выпадения осадка.
Выводы по 5 главе:
1. В результате исследования анатомического строения травы
альфредии поникшей установлено, что микроскопическими
диагностическими признаками цельного и измельченного сырья является
наличие различных типов волосков. На эпидермисе листа расположены
тонкостенные и толстостенные волоски с продольной складчатостью и
простые волоски с многоклеточным основанием. Простые многоклеточные и
звездчато-лучистые волоски следует отнести к диагностическим признакам
цветка. На эпидермисе стебля встречаются многоклеточные волоски с
неравномерными утолщениями и двухрядные волоски.
2. Разработаны методики качественного обнаружения действующих
веществ (флавоноидов) в траве и жидком экстракте альфредии поникшей
методом хроматографии в тонком слое силикагеля.
3. Метод дифференциальной спектрофотометрии с использованием
реакции комплексообразования с алюминия хлоридом положен в основу
разработанной методики количественного определения флавоноидов, в
пересчете на изокверцитрин, в траве и жидком экстракте растения.
3. Определены нормы показателей качества сырья и жидкого экстракта
растения, положенные в основу разработанных проектов ФС «Альфредии
поникшей трава» и «Альфредии поникшей экстракт жидкий».
4. Исследования динамики накопления флавоноидов в траве альфредии
101
поникшей по фазам развития показало, что наибольшее количество
действующих веществ накапливается в период цветения, поэтому заготовку
сырья следует осуществлять в указанную фазу развития. По результатам
исследования органов растения установлено, что максимальное количество
флавоноидов содержится в цветках альфредии поникшей.
102
Выводы
1. Определены морфологические и микроскопические
диагностические признаки травы альфредии поникшей. Диагностическое
значение для цельного сырья имеет форма, окраска и опушение листьев и
стеблей, а также строение корзинок. Микроскопические диагностические
признаки заключаются в наличии различных типов волосков на эпидермисе
листа, стебля и цветка.
2. Установлен химический состав надземной части альфредии
поникшей, представленный простыми фенолами, флавоноидами, лигнанами,
фенолкарбоновыми кислотами, гидроксикумаринами, дубильными
веществами, стеринами, тритерпеновыми соединениями, полисахаридами,
аминокислотами, каротиноидами, макро- и микроэлементами; выявлено, что
надземные части дикорастущей и культивируемой альфредии поникшей
имеют сопоставимый по содержанию химический состав.
3. Разработан рациональный способ получения экстракта альфредии
поникшей на 70 % этаноле, рекомендуемого в качестве ноотропного средства,
заключающийся в использовании соотношения сырье-экстрагент 1:20-1:25,
температуры 80 °С и степени измельчения сырья - 2 мм в течение 90 мин.
4. В экстракте альфредии поникшей на 70 % этаноле установлено
наличие тритерпеновых спиртов (а- и р-амирин, моретенол, лупеол),
лигнанов (арктиин), флавоноидов (кверцетин, изокверцитрин, рутин),
органических кислот (ванилиновая, коричная, хлорогеновая), а также
аминокислот, макро- и микроэлементов.
5. Разработаны методики качественного обнаружения флавоноидов
(изокверцитрин) в траве и жидком экстракте альфредии поникшей методом
хроматографии в тонком слое силикагеля и количественного определения
методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия
хлоридом в видимой области спектра; составлены проекты ФС на
103
лекарственное сырье «Альфредии поникшей трава» и лекарственное средство
«Альфредии поникшей экстракт жидкий».
Список литературы
1. Авруцкий, Г. Я. Клинические аспекты терапии ноотропными
препаратами / Г. Я. Авруцкий, А. Н. Нисс // Фармакология ноотропов.
Под ред. А.В. Вальдмана и Т.А. Ворониной. - М.: ВИНИТИ, 1989. - С.
112-118.
2. Айвазов, Б. В. Практическое руководство по хроматографии / Б. В.
Айвазов. - М.: Высшая школа, 1968. - 280 с.
3. Александрова, А. Е. Антигипоксическая активность и механизмы
действия некоторых синтетических и природных соединений / А. Е.
Александрова // Экспериментальная и клиническая фармакология. -
2005. - Т. 68, № 5. - С. 72-78.
4. Амельченко, В. П. Альфредия поникшая — Alfredia eernua (L.) Cass. / В.
П. Амельченко, Н. А. Игнатенко, Л. А. Малахова // Биологические
особенности растений Сибири, нуждающихся в охране. - Новосибирск:
«Наука». -1988. - С. 12-27.
5. Амельченко, В. П. Биоморфологические и фитохимические
исследования редкого реликтового вида альфредии поникшей в
природных популяциях на юге Томской области и в культуре в
Сибирском ботаническом саду / В. П. Амельченко, Е. А. Серых, М. А.
Ханина // Природокомплекс Томской области. Том И. Биологические и
водные ресурсы. — Томск, 1995. — С. 45-49.
6. Амельченко, В. П. Особенности развития и компонентный состав
Alfredia eernua (Asteraceae) в условиях интродукции (г. Томск) / В. П.
Амельченко, И. В. Шилова, Н. В. Кувачева // Растительные ресурсы. -
2009. - Т. 45, вып. 2 - С. 23-31.
7. Анатомическое строение надземной части альфредии поникшей / Н. В.
Кувачева, И. В. Шилова, В. П. Амельченко и др. // Фармация. — 2006. —
№6.-С. 10-12.

8. Антидепрессантная активность некоторых фитопрепаратов и фенилпропаноидов / В. А. Куркин, А. В. Дубищев, В. Н. Ежков и др. //
Химико-фармацевтический журнал. — 2006. — Т. 40, № 11. — С. 33—38.

9. Антиоксидантная активность некоторых фитопрепаратов, содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды / О. Л. Кулагин, В. А. Куркин, Н. С.
Додонов и др. // Фармация. - 2007. - № 2. - С. 30-32.

10. Антиоксидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного / М. В. Веселова, С. А. Федореев, Н. А.
Василевская и др. // Химико-фармацевтический журнал. — 2007. — Т. 41, № 2. - С. 29-34.

11. Антиоксидантные свойства биологически активных веществ Alfredia
cernua и A. nivea (Asteraceae) / И. В. Шилова, Н. В. Кувачева, Е. И.
Короткова и др. // Растительные ресурсы. - 2008. — Т. 44, вып. 1. — С.
114-121.
12. Артемов, И. А. Высшие сосудистые растения / И. А. Артемов // Флора и
растительность Катунского заповедника (Горный Алтай). -
Новосибирск: «Манускрипт». — 2001. — С. 142—205.
1 З.Артемов, И. А. Степная флора Катунского заповедника (Центральный
Алтай) / И. А. Артемов // Флора и растительность Алтая. - Барнаул. —
2000. -Т. 5, вып. 1. - С . 20-31.
14. Арушанян, Э. Б. Нетрадиционный подход к оценке механизма
специфического действия ноотропных средств / Э. Б. Арушанян //
Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2005. — Т. 68, № 2.
-С. 59-67.
15. Арушанян, Э. Б. Ноотропные свойства препаратов гинкго билоба / Э. Б.
Арушанян, Э. В. Бейер // Экспериментальная и клиническая
фармакология. - 2008. - Т. 71, № 4. - С. 57-63.
16. Арушанян, Э. Б. Препараты корня женьшеня и других растительных
адаптогенов как ноотропные средства / Э. Б. Арушанян //
106
Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71, № 6.
-С. 58-66.
П.Бабченко, Г. А. Оптико-механический согласователь / Г. А. Бабченко.
Патент РФ на изобретение № 31169, опубликован 20.07.2003.
18. Бандюкова, В. А. Применение цветных реакций для обнаружения
флавоноидов путем хроматографии на бумаге / В. А. Бандюкова //
Растительные ресурсы. - 1965. -Т. 1, вып. 4. - С. 591-596.
19.Бандюкова, В. А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды / В.
А. Бандюкова // Химия природных соединений. — 1983. — № 3. — С. 263-
273.
20.Бельник, А. П. Дипептидный препарат ноопент устраняет вызванный
скополамином дефицит пространственной памяти у мышей BALB/c /
A. П. Бельник, Р. У. Островская, И. И. Пролетаева // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. — 2007 —Т. 143, № 4. — С.
407-410.
21.Беляков, К. В. Количественное определение полисахаридов в листьях
мать-и-мачихи (Tussilago farfara L.) / К. В. Беляков, Д. М. Попов //
Фармация. - 1999. -№ 1. - С. 23-24.
22.Березов, Т. Т. Биологическая химия / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. -
М.: Медицина, 2007. - 704 с.
23.Бубенчиков, Р. А. Фенольные соединения и полисахариды фиалки
собачьей / Р. А. Бубенчиков // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология.
Фармация.- 2004. -№ 1.-С. 156-159.
24.Вальдман, А. В. Психофармакотерапия невротических расстройств / А.
B. Вальдман, Ю. А. Александровский. - М., 1976. - 384 с.
25.Венгеровский, А. И. Лекции по фармакологии для врачей и провизоров
/ А. И. Венгеровский. — Томск: STT, 2001. — 576 с.
26.Влияние нооглютила и пирацетама на разные формы оперантного
обучения / А. Н. Иноземцев, Т. Л. Гарибова, И. В. Хромова и др. //
Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1993. - Т. 56., № 2. -С. 6-8.

27. Влияние фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, на физическую работоспособность животных / В. А. Куркин, А. В. Дубищев, Г. Г. Запесочная и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - Т. 40, № 3. - С. 30-31.

28.Влияние экстракта лабазника вязолистного и его фракций на память и
работоспособность в эксперименте / И. В. Шилова, Н. И. Суслов, Н. В.
Провалова и др. // Вопросы биологической, медицинской и
фармацевтической химии. - 2008. - № 6. - С. 81—84.
29.Влияние экстрактов альфредии поншсшей на поведение, память и
работоспособность в эксперименте / Р. Н. Мустафин, Н. И. Суслов, И.
В. Шилова и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. -
2010. -Т. 73, № 1. - С . 16-18.
ЗО.Воробьева, О. В. Сгресс-индуцированные психовегетативные реакции /
О. В. Воробьева // Русский медицинский журнал. - 2005. - Т. 13, № 12 .
-С. 798-801.
31.Воронина, Т. А. Антиоксидант мексидол. Основные
нейропсихотропные эффекты и механизм действия / Т. А. Воронина //
Психофармакология и биологическая наркология. - 2001. - № 1. - С. 2-12.
32.Воронина, Т. А. Новые направления поиска ноотропных препаратов / Т.
А. Воронина//Вестник РАМН. -1998. -№ Ц. - С . 16-21.
33.Воронина, Т. А. Ноотропные и нейротропные средства / Т. А.
Воронина, С. Б. Середенин // Экспериментальная и клиническая
фармакология. - 2007. - Т. 70, № 4. - С. 44-58.
34. Воронина, Т. А. Экспериментальная характеристика
противогипоксических свойств ноотропных препаратов / Т. А.
Воронина // Фармакологическая коррекция гипоксических состояний. —
М., 1989.-С. 125-132.
108
35.Воронина, Т. А. Экспериментальное изучение препаратов с
ноотропным типом действия / Т. А. Воронина, Р. У. Островская //
Ведомости Фармшшлогического Комитета. — 1998. — № 2. - С. 25—31.
Зб.Выделение и анализ природных биологически активных веществ / под
ред. Е. Е. Сироткиной. - Томск: Изд-во ТГУ, 1987. - 184 с.
37.Германова М. А. Заметки натуралиста / М. А. Германова // ЭКО-
бюллетень ИнЭкА. - 2004. - № 6-7 (101-102). - С. 25-35.
38.Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа /
МЗ СССР. - И-е изд. -М.: Медицина, 1987. -336с.
39.Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа.
Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. - 11-е изд.- М.:
Медицина, 1990. -400с.
40.Гребнев, В. И. Сухой экстракт шлемника байкальского — новый
растительный ноотропный препарат / В. И. Гребнев, А. М. Дыгай, Ю.
А. Писарев // TERRA MEDICA nova. - 1999. - № 2. - С. 47-48.
41. Гришина, Е. И. Определитель растений Томской области / Е. И.
Гришина, В. Ю. Андреева. — Томск, 2004. - 132 с.
42.Гуревич, М. А. Артериальная гипертензия, когнитивные расстройства и
мозговой инсульт: особенности терапии / М. А. Гуревич // Фарматека. -
2006.-№8.-С. 43^17.
43.Емелина, Т. Н. Получение углеводородсодержащих субстратов из
вегетативной части топинамбура / Т. Н. Емелина, Т. В. Рязанова, Н. А.
Чупрова // Химия растительного сырья. — 2002. — № 2. — С. 117—119.
44. Емельянов, С. А. Психотропные свойства экстракта листа бадана
толстолистного: Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. биол. наук / С. А.
Емельянов. — Томск, 1993. - 40 с.
45.3айцев, В. Г. Связь между химическим строением и мишенью действия
как основа классификации антиоксидантов прямого действия / В. Г.
Зайцев, О. В. Островский, В. И. Закревский // Экспериментальная и
клиническая фармакология. - 2003. - Т. 66, № 4. — С. 66-70.
109
46.3ахаров, В. В. Когнитивные нарушения в неврологической клинике / В.
В. Захаров // Фарматека. - 2006. - № 7 . - С. 37-43.
47.3ахаров, В. В. Синдром умеренных когнитивных расстройств в
пожилом возрасте: диагностика и лечение / В. В. Захаров, Н. Н. Яхно //
Русский медицинский журнал. — 2004. - Т. 12, № 10. — С. 573-578.
48.3олотухин, Н. И. Изучение разнообразия сосудистых растений в
заповедниках: Методическое пособие и краткий обзор / Н. И.
Золотухин. - М.: КМК Scientific Press Ltd, 1996. - 60 с.
49. Идентификация и количественная оценка флавоноидов в плодах
черемухи обыкновенной / Е. В. Бекетов, А. А. Абрамов, О. В.
Нестерова и др. // Вестник Московского Университета. Химия. — 2005. -
Т. 46,№4.-С. 259-262.
50.Иллюстрированный справочник по лекарственным растениям Сибири.
-Кемерово: ФГУИПП «Кузбасс», 2004.-256 с.
51. Ильин, ML М. Alfredia Fetissowii Iljin sp. nov. / M. M. Ильин //
Ботанические материалы Гербария Главного Ботанического Сада
РСФСР. - 1923. - Т. IV, вып. 5. - С. 38-39.
52.Ильин, М. М. Обзор видов рода Olgaea Iljin и Alfredia Cass. / М. М.
Ильин // Известия Главного Ботанического Сада РСФСР. - 1924. - Т.
XXIII, вып. II. - С. 117-156.
53.Ильин, М. М. Род Alfredia Cass. / М. М. Ильин, Г. Л. Семидел // Флора
СССР. -М., 1963. -Т. 28. - С . 39-43.
54.Исследование аминокислотного состава сфагнума бурого / Н. А.
Буркина, Г. И. Калинкина, Л. В. Фоминых и др. // Химия растительного
сырья. - 2000. - №1. - С. 81-83.
55.Кадыков, А. С. Реабилитация после инсульта / А. С. Кадыкова, Н. В.
Шахпарова // Русский медицинский журнал. - 2003. - Т. 11, № 25. - С.
1390-1395.
56.Карбаинов, Ю. А. Вольтамперометрический способ определения
антиоксидантов в жидких средах / Ю. А. Карбаинов, Е. И. Короткова
ПО
(Коведяева), Т. И. Хаханина. Патент РФ на изобретение № 2001395,
опубликован 27.01.1993, бюл. №3.
57.Ковалев, Г. В. Ноотропные средства / Г. В. Ковалев. — Волгоград: Ниж —
Волж. кн. изд-во, 1990. -368 с.
58.Коротаева, М. С. Содержание флавоноидов и гидроксикоричных кислот
в надземной части Ledum palustre (Ericaceae) / М. С. Коротаева, М. В.
Белоусов, Н. С. Фурса // Растительные ресурсы. - 2008. — Т. 44, вып. 1.
-С. 66-75.
59.Короткова, Е. И. Закономерности процесса электровосстановления
кислорода, осложненного адсорбцией ПАОВ, и их использование в
аналитической практике: Дис. ... канд. хим. наук / Е. И. Короткова. -
Томск, 1995. - 176 с.
бО.Короткова, Е. И. Новый вольтамперометрический способ определения
активности антиоксидантов / Е. И. Короткова, Ю. А. Корбаинов, О. А.
Аврамчик // Тезисы докладов VI Международной конференции
"Биоантиоксидант". - М., 2002. - С. 298-299.
бТКрапивкина, Э. Д. Неморальные реликты во флоре черневой тайги
Горной Шории / Автореф. диссер. на соискание уч. ст. док. биол. наук /
Э. Д. Крапивкина. - Томск, 2007. — 25 с.
62.Красников, А. А. Число хромосом представителей некоторых семейств
флоры Алтая / А. А. Красников, Д. Н. Шауло // Флора и растительность
Алтая. Труды Южно—Сибирского Ботанического сада. - Барнаул: Изд-
во Алтайского университета. — 1995. — С. 178-182.
бЗ.Кривенцов, В. И. Качественная цветная реакция на природные
ароматические карбоновые кислоты, содержащие окси- и
метоксигруппы / В. И. Кривенцов, Л. И. Драник // Химико-
фармацевтический журнал. —1976. — Т. 10, № 7. — С. 90-91.

64.Крикова, А. В. Эффективность диосмина и гесперидина при стрессе у крыс / А. В. Крикова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2007. — № 2. — С. 45-47.

65.Крылов, В. Г. Зеленая аптека Кузбасса / В. Г. Крылов, Э. В. Степанов. - Кемерово, 1975. - 232 с.

66. Крылов, В. Г. Травы жизни и их искатели / В. Г. Крылов. — Томск:Красное знамя, 1992. - 392 с.

67.Ланкин, В. 3. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et contra / В. 3. Ланкин, А. К. Тихазе, Ю. Н. Беленков // Кардиология. - 2004. - Т. 44, № 2. - С. 72-81.

68.Лебедев, А. Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А. Т.
Лебедев. - М.: БИНОМ Лаборатория знаний, 2003. — 493 с.
69.Лекарственные растения и лекарственное сырье, разрешенные к
медицинскому применению в РФ и КНР / Т. Л. Киселева, И. А.
Самылина, А. А. Карпеев и др. // Фармация. — 2008. — № 2. - С. 53—56.
70.Лесиовская, Е. Е. Фармакотерапия с основами фитотерапии. Учебное
пособие / Е. Е. Лесиовская, Л. В. Пастушкова. — М.: Гэотар Медицина, 2003.-592 с.

71. Лоскутова, Е. Тенденции и структура спроса на препараты из лекарственных растений / Е. Лоскутова, О. Базаркина // Российские аптеки. - 2003. - № 3. - С. 38-40.

72.Машковский, М. Д. Лекарственные средства. 14 изд-е. / М. Д.
Машковский. - М.: Новая Волна, 2001. - 540 с.
73.Медикаментозная реабилитация больных, перенесших инсульт / А. А.
Скоромец, А. П. Шумилина, Е. Р. Баранцевич и др. // Мир Медицины. -
2000.-№1-2.-С. 25-29.
74.Методы биохимического исследования растений / Ф. И. Ермаков, В. В.
Арасимович, М. И. Смирнова—Иконникова и др. —Л., 1972. — 456 с.
75.Михалович, Н. А. Антигипоксанты в неотложной терапии черепно-
мозговых травм / Н А . Михалович, Дж. Хак // Русский медицинский
журнал. -2004. -Т. 12, № ю. - С. 621-626.
112
76.Моделирование трехмерной структуры цитохрома 3^50 1А2 и поиск
его новых лигандов / Н. В. Белкина, В. С. Скворцов, А. С. Иванов и др.
// Вопросы медицинской химии. — 1998. — Вып. 5 — С. 465-473.
77.Молодавкин, Г. М. Поведенческий и электрофизиологический анализ
анксиолитической эффективности астрагала монгольского / Г. М.
Молодавкин, Ж. Алдармаа, Т. А. Воронина // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. - 1998. — Т. 134, № 4. - С.
407-409.
78.Молодавкин, Г. М. Психотропные свойства астрагала монгольского /
Г.М. Молодавкин, Ж. Алдармаа, Т.А. Воронина // Экспериментальная и
клиническая фармакология. — 2000. - Т. 63, № 6. — С. 12-14.
79.Морфофункциональная оценка кардиопротекторного действия
производных ГАМК в условиях хронической алкогольной
интоксикации / В. Н. Перфилова, И. Н. Тюренков, В. Б. Писарев и др. //
Бюллетень ВНЦ РАМН и АВО. - 2008. -№1. - С. 16-21.
80.Музыченко, А. П. Особенности использования ноотропных препаратов
в психиатрической практике / А. П. Музыченко // Фармакология
ноотропов.-М.: ВИНИТИ, 1989.-С. 119-124.
81.Муравьева, Д. А. Фармакогнозия / Д. А. Муравьева, И. А. Самылина. -
М.: Медицина, 2002. - 656 с.
82.Намсараева, Г. Т. Коррекция начальных форм сосудисто-мозговой
недостаточности комплексным растительным препаратом / Г. Т.
Намсараева, В. А. Тарнуев // Разгрузочно-диетическая терапия и
традиционная медицина. — СПб.: СпецЛит, 2003. - С. 96-97.
83.Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация / под ред. В. Л.
Багировой, В. А. Северцева. — СПб.: СпецЛит, 2001. — 223 с.
84.Нейропротективные эффекты ноотропного дипептида ГВС—111 при
кислородно-глюкозной депривации, глутоматной токсичности и
оксидативном стрессе in vitro / Н. А. Андреева, Е. В. Стельмашук, Н. К.
113
Исаев и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. —
2000.-Т. 136, № 10.-С. 418-421.
85.Некоторые фармакологические свойства препаратов из надземной
части Scutellaria baicalensis Georgi. / О. В. Першина, Н. И. Суслов, В. Г.
Пашинский и др. // Растительные ресурсы. — 1998. — Т. 34, выа 3. - С.
83-87.
86.Новиков, В. Е. Влияние мексидола на течение посттравматической
эпилепсии / В. Б. Новиков, Н. Н. Маслова // Экспериментальная и
клиническая фармакология. - 2003. — Т. 66, № 4. — С. 9-11.
87.Ноотропная активность некоторых фитопрепаратов и
фенилпропаноидов / В. А. Куркин, А. В. Дубищев, В. Н. Ежков и др. //
Растительные ресурсы. — 2007. — Т. 43, вып. 2. — С. 76-89.
88.Ноотрогшая активность экстрактов надземной части лабазника
вязолистного / И. В. Шилова, Н. И. Суслов, Н. В. Провалова и др. //
Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -
2008.-№4.-С. 24-26.
89.Ноотропные и анксиолитические свойства разных доз пирацетама / Т.
А. Воронина, Г. М Молодавкин, Г. Г. Борликова и др. //
Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. - Т. 63, № 2.
-С. 9-11.
90.Носаль, М. А. Лекарственные растения и способы их применения в
народе / М. А. Носаль, И. М. Носаль. - Л.: Научный центр проблем
диалога, 1991.-240 с.
91. Определение антиоксидантной активности растительного сырья
методом катодной вольтамперометрии / Е. И. Короткова, О. А.
Аврамчик, М. С. Юсубов и др. // Химико-фармацевтический журнал. —
2003. - Т. 37, № 9. - С. 55-56.
92. Определитель растений Кемеровской области / под ред. И. М.
Красноборов. -Новосибирск: СО РАН, 2001. -477 с.

93. Особенности формирования нейродеструктивных процессов и
нейропротективная терапия при заболеваниях нервной системы / М. М.
Одинак, А. В. Холин, И. В. Литвиненко и др. // Журнал неврологии и
психиатрии им. С. С. Корсакова. -2001. -Т. 101, № П. - С . 64-68.
94.Першина, О. В. Психотропные свойства препаратов из надземной части
шлемника байкальского: Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. канд. мед. наук
/ О. В. Першина. - Томск, 1994.-23 с.
95.Польникова, Е. Н. Организация и проведение опытнической работы с
реликтовыми видами растений сем. Норичниковых - Scrophulariaceae:
Методические рекомендации для студентов и учителей биологов / Е. Н.
Польникова. —Горно-Алтайск, 2005. — 15 с.
96.Постреанимационное восстановление функций ЦНС при системном
введении нового пептидного аналога пирацетама / И. В. Назаренко, А.
А. Каменский, Т. А. Гудашева и др. // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины- - 1998. — Т. 138, № 1. — С. 34—37.
97. Преображенская, И. С. Ноотропные препараты в гериатрической
практике / И. С. Преображенская // Русский медицинский журнал. -
2004. - Т. 12, № 5. - С. 256-261.
98.Преч, Э. Определение строения органических соединений / Э. Преч, Ф.
Бюльманн, К. Аффольтер. -М.: Мир, 2006.-438 с.
99.Проворнова, Н. А. Коррекция ноотропами мнестических растройств,
вызванных некоторыми экстремальными воздействиями: Автореф.
дисс. канд. биол. наук / Н. А. Проворнова. - М.э 1999. — 25 с.
100. Пролинсодержащий дипептид ГВС—111 сохраняет ноотропную
активность при пероральном введении / Р. У. Островская, Т. X.
Мирзаев, Г. А. Романова и др. // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины. - 2001. - Т. 137, № 10. - С. 404-408.
101. Противолучевые свойства лекарственного средства "Диквертин" по
микроядерному тесту in vivo при умеренных и малых дозах
ионизирующей радиации / Н. В. Кондакова, С. И. Заичкина, О. М.

Розанова и др. // Вопросы биологической, медицинской и
фармацевтической химии. — 2002. — № 4. - С. 46-49.
102. Пяк, А. И. Alfredia септа (L.) Cass, в Томской области / А. И. Пяк, М.
А. Андреева // Материалы III Международной научной конференции,
посвященной 120-летию Гербария им. П.Н. Крылова Томского
государственного университета «Проблемы изучения растительного
покрова Сибири». - Томск, 2005. - С. 93-94.
103. Растительные лекарственные средства / под ред. Н. П. Максютиной -
Киев: Здоро'я, 1985.-280 с.
104. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический
состав, использование; Семейство Asteraceae (Compositae). — СПб.:
Наука, 1993. -352 с.
Ю5.Ревердатто, В. В. Лекарственные растения семейства губоцветных и
их действующее начало / В. В. Ревердатто // Новые лекарственные
растения Сибири, их лечебные препараты и применение. — Томск, 1953.
- вып. 4. - С. 43-47.
106. Редкие и исчезающие виды природной флоры СССР, культивируемые
в ботанических садах и других интродукционных центрах страны / под
ред. П. И. Лапина-М.: Наука, 1983. - 320 с.
107. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ / под ред. Р. У Хабриева — М.:
Медицина, 2005. - 832 с.
108. Сейфулла, Р. Д. Фармакологическая коррекция факторов,
лимитирующих работоспособность человека / Р. Д. Сейфулла //
Экспериментальная и клиническая фармакология. — 1998. - Т. 61, № 1.
-С. 3-9.
109. Семенова, Г. В. 400 видов флоры Сибири нуждаются в охране / Г. В.
Семенова // Наука в Сибири. - 2006. - № 26-27. - С. 7.
ПО. Середенин, С. Б. Современное состояние и перспективы
лекарственного лечения психических заболеваний / С. Б. Середенин, Т.

A. Воронина // Экспериментальная и клиническая фармакология. -
1992.-Т. 55, №1.-С. 4-10.
111. Смирнов, С. В. Что такое Olgea altaica (Asteraceae)? / С. В. Смирнов //
Turczaninowia. - 2001. - Т. 4, № 4. - С. 18-22 .
112. Современные аспекты поиска эффективных ноотропных средств / О.
Г. Куликова, Л. М. Белявцева, Б. А. Рейхардт и др. // Вестник
Российской академии медицинских наук. - 1992. — № 8. - С. 56-60.
113. Соловьева, А. Д. Лечение головных болей / А. Д. Соловьева, Е. С.
Акарачкова // Русский медицинский журнал. — 2003. — Т. 11, № 21. - С.
1157-1160.
114. Справочник "Национальные парки России" / под ред. И. В. Чебакова.
— М.: Центр охраны дикой природы, 1996. — 198 с.
115. Сравнительное исследование анальгетической активности фрагмента
АКТГф-ю и его аналога семакса / Д. М. Иванова, Н. Г. Левицкая, Л. А.
Андреева и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.
- 2007-Т. 143, № 1.-С. 8-12.
116. Средство, обладающее анксиолитическим действием / Н. И. Суслов,
B. А. Хазанов, И. В. Шилова и др. Патент РФ на изобретение
№ 2354397, опубликован 10.05.2009, бюл. № 13.
117. Средство, обладающее антиоксидантной активностью / И. В. Шилова,
Е. А. Краснов, Н. В. Кувачева и др. Патент РФ на изобретение
№ 2292214, опубликован 27.01.2007, бюл. №3.
118. Средство, обладающее ноотропным действием / И. В. Шилова, Н. И.
Суслов, В. А. Хазанов и др. Патент РФ на изобретение № 2347580,
опубликован 27.02.2009, бюл. №6.
119. Суслина, 3. А. Ишемический инсульт и сердце: от патогенеза к
профилактике / 3. А. Суслина, А. В. Фонякин, Л. А. Гераскина //
Клиническая фармакология и терапия. — 2003. — Т. 12, № 5. — С. 47-51.
120. Суслов Н. И. Патогенетическое обоснование
психофармакологических эффектов препаратов природного

происхождения (экспериментальное исследование): Дисс. докт. мед.
наук. — Томск, 1995. - 406 с.
121.Ткалич, С. IVL Некоторые общие закономерности содержания
химических элементов в золе растений / С. М. Ткалич //
Биогеохимические поиски рудных месторождений. - Улан-Удэ: СО АН
СССР, 1969.-С. 83-90.
122. Тканевая гипоксия, вызванная нитропруссидом натрия, и ее коррекция
растительными средствами / С. Г. Аксиненко, Т. Н. Поветьева, Н. В.
Провалова и др. // Труды Научно-исследовательского института
фармакологии Томского научного центра Сибирского отделения РАМН/
под ред. Е. Д. Гольдберга (Приложение 1 к журналу «Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины» за 2007 год). — М.: РАМН,
2007.-С. 49-53.
123. Тритерпеноиды Onopordum acanthium (Asteraceae) / А. 3. Халилова, Э.
Р. Шакурова, И. Ф. Нуриев и др. // Растительные ресурсы. - 2007. - Т.
43, вып. 1.-С. 97-102.
124. Умаров, С. 3. Фармакоэкономический анализ методов лекарственной
терапии нарушений мозгового кровообращения / С. 3. Умаров //
Фарматека. - 2006. - № 5. - С. 97-100.
125. Уткин, Л. А. Народные лекарственные растения Сибири / Л. А. Уткин
// Труды Научно-исследовательского химико-фармармацевтического
института. -М.; Л., 1931. -Вып. XXIV. - 133 с.
126. Фармакогнозия. Атлас. Том 3 / И. А. Самылина, В. А. Ермакова, Н. В.
Бобкова и др. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 496 с.
127. Фармакокинетика и проницаемость через гематоэнцефалический
барьер нового ацилпролилдипептида с ноотропными свойствами после
перорального введения / С. С. Бойко, Р. У. Островская, В. П. Жердев и
др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2000. -
Т. 136, №4.-С. 426-429.

128. Фармакология ноотропов. Экспериментальное и клиническое
изучение / под ред. А. В. Вальдмана, Т. А. Ворониной. — М: ВИНИТИ,
1989.-139 с.
129. Фармакотерапия гиперактивности с дефицитом внимания у детей:
зарубежный и российский опыт / Н. Н. Заваденко, А. С. Петрухин, Ю.
Б. Белоусов и др. // Фарматека. — 2006. — № 7. — С. 62—70.
130. Фармакоэкономическая эффективность лекарственных средств,
влияющих на центральную нервную систему / А. И. Венгеровский, А.
B. Гришин, Л. Г. Ленская и др. —Новосибирск, 2000. — 176 с.
131. Федин, А. И. Ноотропил. Новое об известном препарате / А. И. Федин
// Аптека и больница. - 1996. -№ 3. - С. 44-58.
132. Федосеева, Л. М. Изучение и сравнительная оценка липофильных
веществ зеленых, красных и черных листьев бадана толстолистного,
произрастающего на Алтае / Л. М. Федосеева, Т. С. Малолеткина //
Химия растительного сырья. - 1999. — № 2. — С. 113-117.
133. Феназепам / Ю. И. Вихляев, Т. А. Воронина, Т. Л. Гарибова и др. -
Киев: Наукова Думка, 1982. — 452 с.
134. Флавоноиды и эфирное масло цветков лаванды колосовой / М.
Ламрини, В. А. Куркин, П. Г. Мизина и др. // Фармация. - 2008. - № 1. -
C. 16-19.
135. Флора Западной Сибири / под ред. П. Крылова.— Томск, 1949. -
Выпуск XI. - С. 2880-2883.
136. Флора СССР / под ред. В.Л. Комарова. - М., 1963. - Том XXVIII. - С.
39-43.
137. Фурса, Н. С. Определение фенольных соединений мази «Ледум» / Н.
С. Фурса, М. С. Коротаева// Фармация. - 2006. -№ 2. - С. 7-9.
138. Химико-фармакологическое исследование активной фракции Atragene
sibirica L. / И. В. Шилова, А. И. Сырчина, Е. А. Краснов и др. // Поиск,
разработка и внедрение новых лекарственных средств и
организационных форм фармацевтической деятельности. - Томск, 2000.
-72 с.
139. Химический анализ лекарственных растений / под ред. Н. И.
Гринкевич, Л. Н. Сафронич — М: Высшая школа, 1983. — 176 с.
140. Хроматография: Практическое приложение метода: В 2х ч. Ч. 2 /
Перевод с англ. Под ред. Э. Хефтмана. — М.: Мир, 1986. — 422 с.
141. Черепанов, С. К. Сосудистые растения России и сопредельных
государств (в пределах бывшего СССР) / С. К. Черепанов. - СПб.: Мир
и семья, 1995. - 992 с.
142. Чернева, О. В. О новом для СССР виде рода Alfredia Cass. / О. В.
Чернева//Новости систематики высших растений. —Л., 1971.-Т. 8. -
С. 253-254.
143. Чуканова, Е. И. Влияние церебролизина на клинические проявления и
течение дисциркуляторной энцефалопатии / Е. И. Чуканова // Журнал
неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова — 2005. — Т. 105, № 1. -
С. 42-45.
144. Шилова, И. В. Адаптогенные и ноотропные свойства густого
экстракта из надземной части Atragene sibirica L. / И. В. Шилова, Н. И.
Суслов, Е. А. Краснов // Растительные ресурсы. - 2001. - Т. 37, вып. 3.
- С. 78-87.
145. Шилова, И. В. Анализ сырья и лекарственных форм Atragene speciosa
Weinm. / И. В. Шилова, Е. А. Краснов, А. А. Блинникова // Здоровье и
образование в XXI веке: Материалы Четвертой Международной научно
— практической конференции. — М — 2003. — С. 687.
146. Шилова, И. В. Исследование биологически активных веществ
Atragene sibirica L. / И. В. Шилова // Бюллетень сибиркой медицины. —
2002.-№2.-С. 55-58.
147. Шилова, И. В. Разработка методики количественного определения
фенолоспиртов в надземной части княжика сибирского / И. В. Шилова,

,\
А. А. Блинникова // Науки о человеке: Материалы четвертого конгресса
молодых ученых и специалистов. — Томск, 2003. — С. 224-225.
148. Шилова, И. В. Химическое исследование экстракта альфредии
поникшей, обладающего ноотропными свойствами / И. В. Шилова,
Н. В. Кувачева // Медицина в Кузбассе. - 2009. — вып. № 3. - С. 118.
149.Шинкаренко, А. Л. Методы исследования природных флавоноидов /
А. Л. Шинкаренко, В. А. Бандюкова, А. Л. Казаков. —Пятигорск, 1977. -
70 с.
150. Широков, Е. А. Дисциркуляторная энцефалопатия: принципы лечения
/ Е. А. Широков // Русский медицинский журнал. - 2004. - Т. 12, № 7. -
С. 471-474.
151. Шталь, Э. Хроматография в тонких слоях / Э. Шталь. — М.: Мир, 1965.
- 508 с.
152. Юнцев, С. В. Сравнительная оценка ноотропных свойств препаратов
радиолы розовой / С. В. Юнцев, Ю. Ф. Белозерцев // Забайкальский
медицинский вестник. - 1997. -№ 1-2. - С. 25-30.
153.Яхно, Н. Н. Когнитивные и эмоционально-аффективные нарушения
при дисциркуляторной энцефалопатии / Н. Н. Яхно, В. В. Захаров //
Русский медицинский журнал. - 2002. - Т. 10, № 12-13. - С. 539—553.
154. Acylated quercetagetin glycosides with antioxidant activity from Tagetes
maxima / L Parejo, J. Bastida, F. Viladomat et al. // Phytochemistry. - 2005.
-Vol. 66, iss. 19. -P. 2356-2362.
155. Antiaging treatments have been legally prescribed for approximately thirty
years / S. V. Ukraintseva, K. G. Arveev, A. I. Miehalsky et ai. // Annals of
the New York Academy of Sciences. - 2004. - N 1019. - P. 64-69.
156. Antibacterial phenolic components from Eriocaulon buergerianum / J.-J.
Fang, G. Ye, W.-L. Chen et al. // Phytochemistry. - 2008. - Vol. 69, iss. 5. -
P. 1279-1286.

157. Astragalus saponins induce growth inhibition and apoptosis in human
colon cancer cells and tumor xenograft / M. Y. Tin Mandy, C.-H. Cho, K.
Chan et al. // Carcinogenesis. - 2007. - Vol. 28, N 6. - P. 1347-1355.
158. Bagchi, D. Cellular protection with proanthocyanidins derived from grape
seeds / D. Bagchi, M. Bagchi, I. Stohs et al. // Annal of the New York
Academy Sciences. -2002. -Vol. 957. - P . 260-270.
159. Bentham, G. Genera Plantarum, II / G. Bentham, J. D. Hooker. - London,
1873-76.-P. 163-533.
160. Birks, J. Cholinesterase inhibitors for Alzheimer's disease / J. Birks //
Cochrane Database of Systematic Reviews. - 2006. - Vol. 25, N 1. - P. 157-
168.
161.Blochina, O. Antioxidants, oxidative damage and deprivation stress / O.
Blochina, E. Virolainen, K. V. Fagerstedt //Annals of Botany. - 2003. - Vol.
91, N2. - P . 179-194.
162. Borsini, F. Is the forced swimming test a suitable model for revealing
antidepressant activity / F. Borsini, A. Meli // Psychophannacology. — 1988.
-Vol. 94,N2.-P. 147-160.
163. Bullock, R. New drugs for Alzheimer's disease and other dementias / R.
Bullock // British Journal of Psychiatry. - 2002. - N 180. - P. 135-139.
164. Cognitive impairment without dementia in older people: prevalence,
vascular risk factors, impact on disability. The Italian Longitudinal Study on
Aging / A. DiCarlo, M. Baldereschi, L. Amaducci et al. // Journal of the
American Geriatrics Society. -2000. -Vol. 48. - R 775-782.
165. Current Practice of Gas Chromatography — Mass Spectrometry / edited by
W. M. A. Niessen. - New York: M. Dekker, 2001. - 507 p.
166. Dietary flavonoids and the risk of colorectal cancer / E. Theodoratou, J.
Kyle, R. Cetnarskyj et aL // Cancer epidemiology biomarkers and
prevention. - 2007. - Vol. 16, N 4. - P. 684-693.
167. Effects of eleven flavonoids from the osteoprotective fraction of Drynaria
fortunei (Kunze) J. SM. on osteoblastic proliferation using an osteoblast-
like cell line / Wang Xin-Luan, Wang Nai-Li, Zhang Yan et al. // Chemical
and Pharmaceutical Bulletin. - 2008. - Vol. 56, N 1. - P. 46-51.
168. Ellington, A. A. Inhibition of Akt signaling and enhanced ERKl/2 activity
are involved in induction of macroautophagy by triterpenoid B-group
soyasaponins in colon cancer cells / A. A. Ellington, M. A. Berhow, K. W
Singletary // Carcinogenesis. - 2006. - Vol. 27, N 2. - P. 298-306.
169. Fast repair of oxidative DNA damage by phenylpropanoid glycosides and
their analogues / S. Yimin, W. Wengfeng, H. Chungyang et al. //
Mutagenesis. -2008. -Vol. 23,N 1. - P . 19-26.
170. Finley, J. W Proposed criteria for assessing the efficacy of cancer
reduction by plant foods enriched in carotenoids, glucosinolates,
polyphenols and selenocompounds / J. W. Finley // Annals of Botany. —
2005. - Vol. 95, N 7. - P. 1075-1096.
171.Flavonoid characterization and in vitro antioxidant activity of Aconitum
anthora L. (Ranunculaceae) / C. Mariani, A. Braca, S. Vitalini et al. //
Phytochemistry. - 2008. - Vol. 69, N 5. - P. 1220-1226.
172. Flavonoid intake and colorectal cancer risk in men and women / J. Lin, S.
M. Zhang, K. Wu et al. // American journal of epidemiology. — 2006. - N
164.-P. 644-651.
173. Flavonoids and the risk of oral and pharyngeal cancer: a case-control study
from Italy / M, Rossi, W. Garavello, R. Talamini et al. // Cancer
epidemiology biomarkers and prevention. - 2007. - Vol. 16, N 8. - P. 1621-
1625.
174. Giurgea, C. E. The nootropic concerpt and its prospective implication / C.
E. Giurgea // Drug Development Research. - 1982. - Vol. 2. - P. 441-446.
175.Haffher, E. On the phylogeny of the subtribe Carduinae (tribe Cardueae,
Compositae) / E. Hafrher. - Englera, 2000. - N 21. - P. 1-209.
176. Harbome, J. B. Occurrence of flavonol 5—methyl ethers in higher plants
and their systematic significance / J. B. Harborne // Phytochemistry. - 1969.
-Vol. 8, N2.-P. 419-423.

177. Hoffinan, О. Compositae in Engler A. and Prantl K. / O. Hoffman // Die
natrliche Pflanzen-Familien. -Leipzig, 1894. -Bd. 4, hf. 5. - S. 87-387.
178. Immunocorrection of altered cytokine production in neurological patients /
O. N. Uchakina, P. N. Uchakin, M. V. Mezentseva et al. // The FASER
Journal. - 2006. - N 20. - P. 187-189.
179. Immunomodulatory Activities of Flavonoids, Monoterpenoids,
Triterpenoids, Iridoid Glycosides and Phenolic Compounds of Plantago
Species / Chiang Lien-Chai, Ng Lean Teik, Chiang Wen et al. // Planta
Medica. -2003. -N 69. - P . 600-604.
180. Isolation and identification of arctiin and arctigenin in leaves of burdock
(Arctium lappa L.) by polyamide column chromatography in combination
with HPLC-ESI/MS / S. Liu, K. Chen, W. Schliemann et al. //
Phytochemical Analysis. - 2005. -Vol. 16, N 2. - P. 86-89.
181.Kazmi, S. M. A. Revision der Gattung Carduus (Compositae). Teil I. / S.
M. A. Kazmi // Mitt. Bot Munchen, 1963. - Bd. V. - S. 139-198.
182. Kazmi, S. M. A. Revision der Gattung Carduus (Compositae). Teil II. / S.
M. A. Kazmi // Mitt. Bot. Munchen, 1964. - S. 279-550.
183.Lawarowa, M. B. Effects of piracetam and standardized ginseng extract on
the electroconvulsive schockinduced memory disturbances in "sten-down"
passive avordance (experiments on albino rats) / M. B. Lawarowa, A. N.
Mosharrof, V. D. Petkov //ActaPhysiologica et Pharmacologica Bulqarica. -
1987,-Vol. 13, N 2 - P . 11-16.
184. Lee, W. J. Inhibition of DNA methylation by caffeic acid and chlorogenic
acid, two common catechol-containing coffee polyphenols / W. J. Lee, В. T.
Zhu // Carcinogenesis. - 2006. - Vol. 27, N 2. - P. 269-277.
185.Lessing, Ch. F. Synopsis generum Compositarum / Ch. F. Lessing. -
Berolini, 1832-R 457.
186. Muhlack, S. Transdermal rivastigmine treatment does not worsen impaired
performance of complex motions in patients with Alzheimer's disease / S.

Muhlack, H. Przuntek, Т. Muller // Pharmacopsychiatry. - 2006. - Vol. 39,
N l . - R 16-19.
187. Mycological and electron microscopic study of Solanum chrysotrichum
saponin SC-2 antifungal activity on Candida species of medical significance
/ A. Herrera-Arellano, L. Martinez-Rivera Mde, M Hernandez-Cruz et al.
// Planta Medica. - 2007. - Vol. 73, N 15. - P. 1568-1573.
188.Nelms, S. Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Handbook / S.
Nelms, C. Mills, J. P. Sterba, - Wiley, 2005. - 504 p.
189.Nobuyoschi, N. Beneficial effects of S-113, a novel herbal prescription, on
impairment model in mice / N. Nobuyoschi, W. Yuan-Liang, S. Hiroshi //
Biological & Pharmaceutical Bulletin. - 1995. - Vol. 18, N 11. - P. 1498-
1503.
190. Petkov, V. D. Medical plants as coqnitive enhacers /V. D. Petkov, A. N.
Mosharrof//Phychopharmacology. - 1988. -Vol. 96, N 1. -P. 44-47.
191. Radioprotective potential of ginseng / T.-K. Lee, R. M Johnke, R. R.
Allison et al. // Mutagenesis. - 2005. - Vol. 20, N 4. - P. 237-243.
192. Seyoum, A. Structure-radical scavenging activity relationships of
flavonoids / A. Seyoum, K. Asres, К К. El—Fiky // Phytochemistry. - 2006. -
Vol. 67, N 18. -P. 2058-2070.
193.Sierpina, V. S. Ginkgo Biloba / V S. Sierpina, B. Wollschlaeger, M.
Blumenthal //American Family Physician. - 2003. -Vol. 68, N. 5. - P . 923-
925.
194. Staniforth, V. Caffeic acid suppresses UVB radiation-induced expression
of interleukm—10 and activation of mitogen—activated protein kinases in
mouse / V. Staniforth, L —T. Chiu, N.-S. Yang // Carcinogenesis. - 2006. -
Vol. 27, N 9. - P. 1803-1811.
195. Structure-activity relationships of flavonoids for vascular relaxation in
porcine coronary artery / Y. С Xu, S. W. S. Leung, D. K. Y. Yeung et al. //
Phytochemistry. - 2007. - Vol. 68, N 8. - P. 1179-1188.

/
196. Supervised exercise training combined with ginkgo biloba treatment for
patients with peripheral arterial disease / J. Wang, S. Zhou, R. Bronks et al.
// Clinical Rehabilitation. - 2007. - Vol. 21, N 7. - P. 579-586.
197. Tiwari, P. Anti-Trichomonas activity of Sapindus saponins, a candidate for
development as microbicidal contraceptive / P. Tiwari, D. Singh, M M.
Singh // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. - 2008. - Vol. 10. - P.
1093.
198. Topoisomerase 11 inhibition and high yield of endoreduplication induced
by the flavonoids luteolin and quercetin / G. Cantero, C. Campanella, S.
Mateos et al. // Mutagenesis. - 2006. - N 21. - P. 321-325.
199. Tribal and Subtribal Delimitation and Phylogeny of the Cardueae
(Asteraceae): A Combined Nuclear and Chloroplast DNA Analysis / Nuria
Garcia-Jacas, Teresa Garnatje, Alfonso Susanna et al. // Molecular
Phylogenetics and Evolution. - 2002. -Vol. 22, iss. 1. - P . 51-64.
200. Wang, Y.-J. Phyiogenetic Origins of the Himalayan Endemic Dolomiaea,
Diplazoptilon and Xanthopappus (Asteraceae: Cardueae) Based on Three
DNA Regions / Y.-J. Wang, J.-Q. Liu, G. Miehe // Annals of Botany. -
2007. - Vol. 99, N 2. - P . 311-322.
201. Watanabe, H. H. Candidates for cognitive enhancer extracted from
medicinal plants: Paeoniflorin and tetramethilpyrazine / H. H. Watanabe //
Behavioural Brain Research. - 1997. -Vol. 83, N 1-2. - P . 135-141.
202. Wielgorskaya, T. Dictionary of generic names of Seed Plants / T.
Wielgorskaya. -New York: Columbia University press, 1995. - 570 p.
203. Wiesman, Z. Larvicidal activity of saponin containing extracts and
fractions of fruit mesocarp of Balanites aegyptiaca / Z. Wiesman, B. P.
Chapagain //Fitoterapia. -2006. -Vol. 77, iss. 6. - P . 420-424.
Благодарности
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность д. х. н,
профессору Иркутского технического университета Семенову А. А., д. м. н.,
профессору НИИ фармакологии СО РАМН Суслову Н. И. за помощь в
организации аналитических исследований и обсуждении полученных
результатов. За предоставленные для исследования образцы растения
выражаю благодарность д. б. н., проф. Томского государственного
университета Пяку А. И., к. б. н., с. н. с. Сибирского ботанического сада
Томского государственного университета Амельченко В. П.

В результате исследования антиоксидантной активности установлено,
что экстракты из надземной части альфредии поникшей проявляют
активность по отношению к процессу электровосстановления кислорода, т. е.
все образцы взаимодействуют с активными кислородными формами.
Использование в качестве экстрагента водноых растворов этанола
способствует увеличению антиоксидантных свойств за счет извлечения
наиболее полного комплекса БАВ (рис. 1, табл. 1). Наиболее выраженной
активностью обладают наиболее липофильные экстракты альфредии
поникшей на 70 % и 95 % этаноле, которые по эффекту приближаются к
активности дигидрокверцетина [11, 117].

В результате исследования антиоксидантной активности фракций
фармакологически активного экстракта альфредии на 70 % этаноле
установлено, что все образцы проявляют антиоксидантную активность. В
ряду экстракта и фракций наиболее выраженные свойства у хлороформной
фракции, активность которой превышает показатель аскорбиновой кислоты и
дигидрокверцетина. Наименьшую активность показал водный остаток

Исследования антиоксидантного действия индивидуальных соединений
(см. главу 4) показали, что наиболее выраженными свойствами обладают
гликозиды флавоноидов — изокверцитрин и рутин, активность которых
132
превышает активность дигидрокверцетина, аскорбиновой кислоты и р-
ионола, что согласуется с литературными данными [9, 10]. Несколько
меньшую активность проявляет арктиин - лигнан, выделенный из
хлороформной и этилацетатной фракций активного экстракта растения.
Значительный вклад в антиоксидантную активность экстракта альфредии
поникшей на 70 % этаноле вносит также коричная кислота и сумма
тритерпеновых соединений, значения критерия антиоксидантнои активности
которых также превышает аналогичные характеристики дигидрокверцетина,
аскорбиновой кислоты и р-ионола.
Приложение 2
Исследование ноотропной активности экстрактов, фракций
и индивидуальных веществ альфредии поникшей
Фармакологические исследования выполняли на 170 беспородных
мышах обоего пола массой тела 20 - 22 г и 40 беспородных крысах обоего
пола массой 200 - 220 г.
Эксперименты проводили в осенне-зимний период. Работы в рамках
экспериментальных методик выполняли с 10 ч утра и заканчивали к 15 ч.
Животные содержались в виварии на обычном рационе кормления при
свободном доступе к воде и пище (за исключением тех случаев, где иные
условия оговариваются особо). Умерщвление животных осуществляли
передозировкой эфирного наркоза.
В качестве препаратов сравнения использовали пирацетам
(«Ноотропил», UCB S.A. Pharma Sector, Бельгия) в дозе 400 мг/кг, как
эталонный препарат на ноотропную активность, гинсана (Pharmaton,
Швейцария) в дозе 100 мг/кг и феназепам («Валента Фармацевтика», Россия)
в дозе 1 мг/кг как эталонный препарат на анксиолитическую активность.
Экстракты альфредии поникшей вводили в дозе 100 мг/кг, фракции экстракта
на 70 % этаноле в эквивалентных количествах (относительно содержания в
экстракте). Экстракты, фракции и препараты сравнения вводили зондом в
133
Фармакологические испытания выполняли в соответствии с
рекомендациями Фармакологического государственного комитета
Минздравсоцразвития РФ [107].
Ориентировочно-исследовательское поведение изучали в условиях
методики «открытое поле». При этом использовали квадратную камеру
размером 40x40x20 см. Ее пол был разделен на 16 квадратов с отверстием в
центре. Регистрацию проводили в течение 2 мин. Подсчитывали
перемещения с квадрата на квадрат (горизонтальная активность), количество
вставаний на задние лапки (вертикальная активность), количество
обследований отверстий (норковый рефлекс), количество умываний
(груминг) и количество актов дефекации по количеству фекальных шариков
(болюсов), вычисляли коэффициент асимметрии поведения в виде отношения
количества горизонтальных перемещений к общей двигательной активности,
выраженного в процентах [107].
Влияние гипоксической травмы на животных оценивали по
изменениям ориентировочно-исследовательского поведения, как это уже
было описано выше, и по сохранности условного рефлекса пассивного
избегания (УРПИ), которое проводили на модели гипоксии гермобъема [107].
При этом использовали термокамеру объемом 500 мл, выработку УРПИ [120]
проводили непосредственно перед помещением в термокамеру, а проверку
рефлекса - через 24 ч после выработки. Экспериментальная установка для
выработки УРПИ представляла собой камеру, состоящую из двух отсеков:
большого - освещенного и малого — темного с электродным полом. Животное
помещали в светлый отсек и вскоре, в силу . врожденного рефлекса
предпочтения темного пространства, оно переходило в малый отсек, после
чего на пол подавали электрический ток. В результате описанной процедуры
у животных вырабатывался условный рефлекс избегания темного
пространства. При проверке сохранности рефлекса животных помещали в
светлый отсек. Сохраненным рефлекс считался, если в течение 3 мин
134
наблюдения животное ни разу не посетило темный отсек.
Влияние хронической гипоксии определяли, выдерживая животных в
термокамере ежедневно в течение 4 дней до атонального дыхания, в
последний день эксперимента — до гибели животного. При этом возникали
изменения во внутренних органах. Степень повреждения оценивали в баллах
[120] по изменениям массы селезенки, тимуса и надпочечников, общей
клеточности тимуса и селезенки и процесса язвообразования на слизистой
желудка.
Поведение в конфликтной ситуации является одной из наиболее
распространенных моделей невроза. Она позволяет с достаточной
достоверностью предсказать противоневротические свойства препаратов
[133, 162]. В наших экспериментах конфликтная ситуация моделировалась
путем столкновения двух рефлексов: питьевого условного рефлекса и
безусловного рефлекса избегания электроболевого раздражения. Для этого
животных предварительно оставляли на двое суток без воды, затем в течение
4 суток на 20 мин ежедневно помещали в пластиковую камеру размерами
30x40x20 см, в одной из торцевых стенок которой была устроена ниша с
поилкой, где крыса могла напиться. Препараты вводили, начиная с первого
дня обучения, в желудок за 1 час до помещения в камеру, контрольным
животным вводили воду. В день регистрации результатов через 1 час после
очередного введения препарата крыс снова помещали в камеру и между
металлическим полом камеры и электродом, опущенным в поилку,
создавалась разность потенциалов в 80 вольт. Таким образом, при попытке
взятия воды животное получало удар током. Об анксиолитической
активности препарата судили по разнице в числе взятий воды, несмотря на
удар током (наказуемое взятие воды), в контрольной и опытной группах.
Дополнительными показателями, характеризующими условно-рефлекторную,
эмоциональную и смещенную активность, служили число подходов к поилке,
горизонтальные перемещения по клетке, груминг, число вертикальных стоек.
135
горизонтальные перемещения по клетке, груминг, число вертикальных стоек.
Каждое животное наблюдали индивидуально в течение 20 мин.
Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически с
использованием параметрического критерия Фишера и непараметрического
критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и метода Фишера для сравнения долей
[107].
Проведенные ранее исследования показали, что наиболее активной для
животных является доза экстракта 100 мг/кг [118]. Сравнительное
исследование водного и водно-этанольных (40 %, 70 % и 95 %) экстрактов
выявило, что экстракт растения на 70 % этаноле в дозе 100 мг/кг проявляет
наиболее выраженную ноотропную активность: нормализует показатели
ориентировочно-исследовательского поведения, ориентировочный рефлекс и
условно-рефлекторную деятельность животных после гипоксического
воздействия. Активность экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле
соответствует эффекту пирацетама и превышает таковой препарата
«Гинсана» (табл. 3).
Сравнительное исследование ноотропной активности экстрактов
надземной части альфредии поникшей дикорастущей и культивируемой на
70 % этаноле выявило, что изучаемые экстракты в равной мере
восстанавливают эксплоративное поведение, ориентировочный рефлекс
после гипоксической травмы (табл. 3), с незначительным преимуществом
экстракта дикорастущего растения по влиянию на сохранность условного
рефлекса пассивного избегания.
Фармакологические испытания экстрактов альфредии поникшей,
полученных методом нагревания и противоточной экстракции, показали
равнозначность оказываемых эффектов (табл. 4).


Экстракт альфредии поникшей на 70 % этаноле, проявляющий
наиболее выраженные ноотропные свойства, подвергали исследованию на
других фармакологических моделях.
Исследование влияния хронической гипоксии гермообъема показали,
что последняя вызывала комплекс изменений в поведении, внутренних
органах и системах животных. Так, в группе гипоксического контроля
регистрировали снижение ориентировочно-исследовательской активности в
«открытом поле» и увеличение асимметрии в поведении, уменьшение массы
тимуса на 45 %, увеличение массы надпочечников на 21 %, уменьшение
общей клеточности селезенки и тимуса на 33 %, а также процесс
язвообразования в желудке по сравнению с интактной группой (табл. 5).
Введение экстракта альфредии поникшей уменьшает выраженность большей
части изменений, вызванных хронической гипоксией. Так, использование
экстракта альфредии приводит к нормализации показателей суммарной
двигательной активности, снижению массы надпочечников в среднем на
16%, сокращению числа эрозивных и геморрагических деструкции в 3,6
раза, относительно гипоксического контроля; общая клеточность селезенки и
тимуса восстанавливается до уровня интактного контроля (табл. 5). При этом
активность экстракта альфредии несколько превосходит эффект пирацетама.
138
Проведенные исследования показали, что экстракт альфредии
поникшей способствует увеличению количества наказуемых взятий воды и
подходов к поилке в условиях модели «конфликтная ситуация» (табл. 6), что
указывает на присущие ему анксиолитические свойства. В наиболее
эффективной дозе (100 мг/кг) исследуемый экстракт незначительно уступает
эталонному препарату по транквилизирующему действию - феназепаму и
превосходит пирацетам.
Экстракт альфредии также активирует ориентировочно-
исследовательского поведение животных в условиях экспериментального
конфликта, превосходя по действию феназепам и соответствуя эффекту
пирацетама. Указанные обстоятельства свидетельствуют об эффективности
применения изучаемого экстракта для снятия депрессии поведения,
вызываемой конфликтной ситуацией, и отсутствии у экстракта
депримирующих свойств. Дополнительно, в случае применения
исследуемого экстракта растения характерно уменьшение латентного
времени питья, что свидетельствует об улучшении выработки рефлекса у
животных. Таким образом, экстракт альфредии обладает анксиолитическим
действием и не имеет наиболее существенных побочных эффектов
феназепама и пирацетама [116].

Таким образом, при экспериментальном изучении влияния экстракта
альфредии поникшей на 70 % этаноле на отдельные патологические
состояния выявлена выраженная нормализация показателей эксплоративного
поведения, условно-рефлекторной деятельности, внутренних органов
животных после перенесенного гипоксического воздействия, при отсутствии
существенного влияния на поведение нормальных животных;
антистрессорное и анксиолитическое действие [29].
Для установления носителей ноотропных свойств, экстракт надземной
части альфредии поникшей на 70 % этаноле фракционировали, подвергали
хроматографическому разделению (см. главу 4) и исследовали
антиоксидантную и ноотропную активность полученных фракций и
выделенных индивидуальных веществ. Оценку ноотропного действия
осуществляли по влиянию на оринтировочно-исследователькое поведение,
сохранность условного рефлекса пассивного избегания после перенесенного
гипоксического воздействия и поведение в «конфликтной ситуации».
В результате исследований установлено, что воздействие фракций
проявляется не одинаково. Так, хлороформная фракция вызывает увеличение
времени пребывания в условиях термокамеры, способствует нормализации
ориентировочной и исследовательской активности после их нарушения,
спровоцированного гипоксической травмой. Все фракции экстракта,
особенно этилацетатная и бутанольная, снижают смещенную активность
(груминг) после гипоксии. Положительное влияние на память после
гипоксического воздействия оказывают все фракции экстракта, но наиболее
выраженное антиамнестическое действие показывают водный остаток и
бутанольная фракция (табл. 7).
Исследуемые фракции увеличивают количество наказуемых взятий
воды на модели «конфликтная ситуация», однако наибольшей
анксиолитической активностью обладает хлороформная фракция.
141
Таким образом, при разделении на фракции выявили рассредоточение
на составные части ноотропного эффекта, что указывает на специфический
эффект суммы БАВ экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле.
Хлороформная фракция проявляет наиболее выраженную
антигипоксическую и анксиолитическую активность. Антиамнестические
свойства в наибольшей степени присущи водному остатку и бутанольной
фракции.
Исследования фармакологической активности индивидуальных
веществ, выделенных из экстракта альфредии поникшей на 70 % этаноле,
показали, что они также проявляют различные свойства (табл. 8).
Исследуемые вещества не оказывают достоверного влияния на время
пребывания животных в термокамере и на эксплоративное поведение
животных в «открытом поле» после гипоксии. Использование суммы
тритерпеновых спиртов и арктиина способствует нормализации показателя
ориентировочной деятельности. Наиболее выраженным положительным
влиянием на память обладает ОВ-2. Также высокая активность характерна
сумме тритерпеновых спиртов, арктиину и изокверцитрину, в порядке
уменьшения. Наименьшим антиамнестическим действием характеризуется
рутин. Следовательно, тритерпеновым соединениям и лигнанам (в меньшей
степени), свойственен выраженный ноотропный эффект, а флавоноиды
различаются по активности в зависимости от структуры.

Без лекарственных растений невозможно представить современную профилактику и терапию большинства заболеваний, разработку новых препаратов. [Лоскутова, Е. Тенденции и структура спроса на препараты из лекарственных растений / Е. Лоскутова, О. Базаркина // Российские аптеки. - 2003. - № 3. - С. 38-40.]. Применяемые и исследуемые в настоящее время синтетические ноотропные средства эффективны, однако вызывают разнообразные нежелательные эффекты.

Последнее обстоятельство представляется особенно неблагоприятным, если принять во внимание длительность приема ноотропных лекарственных средств. Отсюда следует, что поиск новых эффективных и малотоксичных ноотропных препаратов продолжает оставаться актуальной проблемой. Интересным и перспективным является изучение средств природного и, в частности, растительного происхождения, как потенциальных источников новых ноотропных лекарственных средств, отличающихся малой токсичностью, большей частью мягкостью действия и редким индуцированием аллергических реакций.

Анализ литературных данных свидетельствует о создании новых ноотропных препаратов на основе лекарственных растений, таких как гинкго билоба, бадан толстолистный, княжик сибирский, шлемник байкальский, пион уклоняющийся, родиола розовая, женьшень, лимонник китайский, астрагал монгольский и др.

Препараты, содержащие стандартизированный экстракт африканского дерева гинкго билоба (билобил, танакан, мемоплант, гинкго билоба и др.), обладают ноотропной активностью и практически не вызывают побочных эффектов. Основными действующими веществами экстракта являются флавоноидные гликозиды, терпеновые лактоны и гинкголиды, оказывающие разнонаправленное положительное воздействие на различные звенья патогенеза заболевания. Под воздействием гинкго билоба нормализуется тонус артерий и вен, улучшаются реологические свойства крови (снижается степень агрегации тромбоцитов и нейтрофилов, повышается эластичность мембран эритроцитов и их способность к деформации при прохождении ими капиллярного русла), улучшается снабжение ишемизированной ткани кислородом и глюкозой, ускоряются процессы выведения углекислого газа и молочной кислоты. Мощное антиоксидантное действие компонентов растения позволяет защитить клетки головного мозга от разрушительного воздействия свободных радикалов при окислительном стрессе, который развивается при ишемических состояниях и старении организма Гинкго билоба так же воздействует на высвобождение, повторное поглощение и катаболизм нейромедиаторов и, возможно, на их способность к соединению с мембранными рецепторами [15, 55,128,193,196].

Пеонифлорин, полученный из пиона, уменьшает нарушения обучаемости в результате снижения числа ошибок при воспроизведении пищедобывательного навыка [201].

Сухой экстракт шлемника байкальского обладает широким спектром фармакологической активности: нормализует процессы обучения и памяти в условиях высокого психоэмоционального напряжения, а также при ослаблении интегративных и мнестических функций мозга при их нарушении в результате воздействия ряда факторов физической и химической природы или вследствие ишемии мозга; обладает выраженным анксиолитическим, стресспротективным и антиоксидантным действием [40,85, 94].

Большой интерес представляют лекарственные растения, содержащие фенилпропаноиды, для которых обнаружены тонизирующие, адаптогенные, иммуномодулирующие и ноотропные свойства [87].

Положительные результаты получены при действии экстракта родиолы розовой и выделенных из него соединений - салидрозида и розавина, на показатели познавательных функций при выработке активных и пассивных избеганий на белых беспородных крысах и мышах. При этом установлено, что экстракт родиолы и салидрозид оказывают церебропротекторное действие в условиях гипоксии. Розавин повышает выносливость животных по сравнению с экстрактом, салидрозидом и более эффективен при амнезии, вызванной повреждением мозга путем электрошока [3, 152].

Установлено, что лекарственное средство, содержащее экстракты туйи восточной, женьшеня и шлемника, оказывает благотворное влияние на память, обучение интактных и с нарушенной обучаемостью мышей на моделях пассивного и активного избегания, укрытия на платформе и нажатия нарычат [189].

Экстракт астрагала монгольского обладает анксиолитическим эффектом, вызывает активацию двигательной активности животных в условиях принудительного плавания [77, 78, 105]. Определенный интерес представляют результаты изучения экстракта из зеленых листьев бадана толстолистного, который улучшает условно-рефлекторную деятельность в условиях стресса и конфликтной ситуации, оказывает благоприятное влияние на процессы обучения и памяти, обладает антигипоксическими свойствами [44].

При исследовании влияния экстракта из надземной части княжика сибирского выявлено его антистрессорное, транквилизирующее действие, способность улучшать физическую работоспособность, условно-рефлекторную деятельность и поведение животных после перенесенной гипоксической травмы и в условиях экспериментальной ишемии головного мозга [138, 144, 145, 146, 147].

При исследовании сохранности условного рефлекса пассивного избегания и принудительном плавании животных с утяжеляющим грузом обнаружены ноотропные и адаптогенные свойства надземной части лабазника вязолистного [28, 88].

Нейропсихические исследования подтвердили положительное действие комплексного растительного средства, состоящего из шлемника байкальского, горца птичьего, сушеницы топяной, плодов шиповника, курильского чая, шюна уклоняющегося и кровохлебки, на когнитивные функции. Отмечено улучшение психических функций, прежде всего внимания и умственной работоспособности [82].

На основе экстракта корня белого женьшеня Panax ginseng С.А. Меу., выращиваемого в Швейцарии, разработано и выпускается лекарственное средство гинсана (фирма Pharmaton, Швейцария). Его клинический эффект основан на повышении уровня кислорода клетками организма и ускорении
его транспортировки; повышении потребления кислорода;
улучшении клеточного обмена веществ;
уменьшении содержания молочной кислоты;
уменьшении усталости и боли в мышцах, ускорении восстановления после физической нагрузки.

Стандартизация препарата проводится методом ВЭЖХ по сумме тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда.

Способность растительных препаратов, издревле используемых для улучшения познавательной деятельности, в последние годы получила подтверждение исследованиями механизмов действия растительных компонентов на клеточном уровне. Установлено, что биологически активные вещества растений при комплексном их применении могут обеспечить защиту центральных нейронов от повреждений, усилить процессы регенерации в головном мозге и улучшить мозговую гемодинамику [16].

- Антидепрессантная активность некоторых фитопрепаратов и фенилпропаноидов / В. А. Куркин, А. В. Дубищев, В. Н. Ежков и др. // Химико-фармацевтический журнал. — 2006. — Т. 40, № 11. — С. 33—38.

- Антиоксидантная активность некоторых фитопрепаратов, содержащих флавоноиды и фенилпропаноиды / О. Л. Кулагин, В. А. Куркин, Н. С. Додонов и др. // Фармация. - 2007. - № 2. - С. 30-32.

- Антиоксидантная активность полифенолов из дальневосточного растения тиса остроконечного / М. В. Веселова, С. А. Федореев, Н. А. Василевская и др. // Химико-фармацевтический журнал. — 2007. — Т. 41, № 2. - С. 29-34.

- Влияние фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, на физическую работоспособность животных / В. А. Куркин, А. В. Дубищев, Г. Г. Запесочная и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - Т. 40, № 3. - С. 30-31.

- Крикова, А. В. Эффективность диосмина и гесперидина при стрессе у крыс / А. В. Крикова // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2007. — № 2. — С. 45-47.

- Крылов, В. Г. Зеленая аптека Кузбасса / В. Г. Крылов, Э. В. Степанов. - Кемерово, 1975. - 232 с.

- Крылов, В. Г. Травы жизни и их искатели / В. Г. Крылов. — Томск:Красное знамя, 1992. - 392 с.

- Ланкин, В. 3. Антиоксиданты в комплексной терапии атеросклероза: pro et contra / В. 3. Ланкин, А. К. Тихазе, Ю. Н. Беленков // Кардиология. - 2004. Т. 44, № 2. - С. 72-81.

Глицин — естественный тормозной медиатор нервной системы, действующий как в пределах головного, так и в спинном мозге.
Ноотропный эффект препарата сочетается с мягким седативным действием. Глицин обладает некоторой анксиолитической активностью, снижает повышенный мышечный тонус, обладает противосудорожным эффектом.
Назначают как дополнительный препарат в терапии ишемии - гипоксии мозга, при лечении неврозов и спастичности.

Принимает участие в активации участка NMDA рецептора и длительной потенциации нейронов гиппокампа,
а следовательно и усиления синаптической передачи. К препаратам этой группы относят глицин и
милацемид (аналог глицина), улучшающие память, как в эксперименте, так и у человека.

Аминокислота глицин входит в состав многих белков и биологически активных соединений. Из глицина в живых клетках синтезируются порфирины и пуриновые основания. Глицин также является нейромедиаторной аминокислотой, проявляющей двоякое действие.

Глициновые рецепторы имеются во многих участках головного мозга и спинного мозга. Глицин является регулятором обмена веществ, нормализует и активирует процессы защитного торможения в ЦНС, уменьшает психоэмоциональное напряжение, повышает умственную работоспособность.
Устраняет депрессивные нарушения, раздражительность, нормализует сон, снижает патологическое влечение к алкоголю.