Альфредия поникшая (Alfredia cernua)

УДК 615.322:582.099:543.544
ФИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАВЫ АЛЬФРЕДИИ ПОНИКШЕЙ МЕТОДОМ ВЭЖХ

А.А. Бакибаев, Р.Н. Мустафин1, А.В. Пустовойтов1, Е.В. Дорожко1, А.Ю. Тамурко1, Е.В. Петрова1, В.П. Амельченко2
Национальный исследовательский Томский политехнический университет, пр. Ленина, 30, Томск, 634050, (Россия), е-таИ: ги81ати81аЩ81ЬтаИ.сот 2Национальный исследовательский Томский государственный университет, Сибирский ботанический сад, пр. Ленина, 36, Томск, 634050 (Россия)
Целью работы является фотохимический анализ травы альфредии поникшей на присутствующие в растении флавоноиды, с использованием метода ВЭЖХ и УФ-спектроскопии. Сравнение хроматограмм и УФ-спектров компонентов спиртового извлечения и стандартных образцов рутина и кверцетина показало, что метод ВЭЖХ может быть использован для определения подлинности травы альфредии поникшей по флавоноидному компоненту (рутину). Методика идентификации и установленные параметры могут быть включены в комплекс нормативов для травы альфредии как один из идентификационных тестов.
Ключевые слова: альфредии поникшей трава, флавоноиды, ВЭЖХ, УФ-спектроскопия.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» Министерства образования и науки ГК №14.837.21.0566.

Целью работы является фотохимический анализ травы альфредии поникшей на присутствующие в растении флавоноиды, с использованием метода ВЭЖХ и УФ-спектроскопии. Сравнение хроматограмм и УФ-спектров компонентов спиртового извлечения и стандартных образцов рутина и кверцетина показало, что метод ВЭЖХ может быть использован для определения подлинности травы альфредии поникшей по флавоноидному компоненту (рутину). Методика идентификации и установленные параметры могут быть включены в комплекс нормативов для травы альфредии как один из идентификационных тестов.
Ключевые слова: альфредии поникшей трава, флавоноиды, ВЭЖХ, УФ-спектроскопия.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» Министерства образования и науки ГК №14.837.21.0566.
Введение
Ранее были определены фармакогностические показатели сырья для травы альфредии поникшей (А1/гесИа сетиа (Ь.) Сам; семейство А&егасеае) и разработан проект ФС «Альфредии поникшей трава» [1].

В качестве метода для качественного обнаружения флавоноидов в траве альфредии использовали хроматографию в тонком слое силикагеля (ТСХ).

Целью работы явился фитохимический анализ травы альфредии поникшей на присутствие флавоноидов веществ с наиболее широким спектром активности.

Экспериментальная часть
В работе использовали надземную часть альфредии поникшей, собранной на экспериментальном участке Сибирского ботанического сада при Томском государственном университете в июле 2012 г. Высушенное воздушным способом сырье измельчали и просеивали через сито с диаметром отверстий 0,63 мм.
Аналитическую пробу получали экстрагированием измельченного сырья 95% этанолом в течение 60 мин. В качестве стандартов при хроматографическом определении использовали стандартные образцы веществ-свидетелей (СОВС) рутина и кверцетина.
Исследование сводилось к разработке способа идентификации травы альфредии поникшей с использованием ВЭЖХ и УФ-спектроскопии. С этой целью применяли двухканальный жидкостный хроматограф «Милихром А-02» со спектрофотометрическим детектором (190-360 нм) и программным обеспечением «Мультихром» АО «Амперсенд». Сорбент - Ргопго81Ь 120-5-С18 Ар с размером частиц 5 мкм; колонка размером 15x2 мм.

Обсуждение результатов
Первоочередной задачей для достижения поставленной цели являлось определение условий хрома-тографического разделения этанольного извлечения альфредии поникшей на компоненты. Природу их можно установить с помощью различных физико-химических методов: ИК-Фурье, ЯМР 13С, :Н, масс-спектрометрии и др. [8-13], среди которых метод ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием и регистрацией спектров в остановленном потоке является предпочтительным ввиду широкой распространенности, высокой чувствительности УФ-детекторов к различным соединениям, стабильности, нечувствительности к изменению температуры и скорости потока, широким линейным диапазоном и пределом обнаружения в несколько нанограммов [14].
Для решения указанной задачи экстракт альфредии на 95% этаноле подвергли обращеннофазному разделению на хроматографе в различных вариантах. Выбор остановили на следующих параметрах: компоненты подвижной фазы - 3,5% уксусная кислота (канал А) и ацетонитрил (МеС]\Г, канал Б). Программа градиента подвижной фазы: 0-3 мин - 0% МеС1Ч; 3 мин - 15% МеС1Ч; 25 мин - 25% МеС1Ч; 25 мин - 70%; 42 мин - 100% МеС1\Г; расход элюента - 100 мкл/мин; длина волны - 350 нм; температура колонки - 35 °С; объем вводимой пробы - 5 мкл.
При выбранных условиях достигали достаточно полного разделения на компоненты. Методику определения подлинности травы альфредии с помощью ВЭЖХ выполняли следующим образом: около 0,5 г измельченной и просеянной травы альфредии поникшей помещали в стеклянный флакон на 10 мл, заливали 10 мл 95% этилового спирта, закрывали флакон капроновой крышкой и оставляли на 1 ч в темном месте при комнатной температуре. Полученное извлечение фильтровали через бумажный фильтр в приемник (стеклянный флакон). На выходе получили 6 мл аналитической пробы (потеря объема за счет поглощения экстрагента сырьем).

Сравнивая спектры компонентов извлечения с литературными данными [15], мы пришли к выводу, что спектры двух соединений могут принадлежать ароматическим гидрокси- или меток-силированным спиртами кислотам. Некоторые другие компоненты с большей вероятностью могли относиться к соединениям группы флавоноидов.

УФ-спектры СОВС рутина и пика, предположительно соответствующего ему на хроматограмме аналитической пробы, имеют при длине волны 282 нм практически идентичную интенсивность поглощения (етах=218-220). Полуширина полос поглощения СОВС и пробы (5=8,3 нм), а также соотношение между длинами волн при етах и ешшт тоже были тождественны. Следовательно, выделенный на рисунке 1в пик может принадлежать рутину. Поиск соответствия с хроматограммой кверцетина не дал положительного результата: заметного пика на хроматограмме извлечения не наблюдали. Это связано с двумя причинами. Во-первых, кверцетин в растении находится преимущественно в связанном состоянии - в виде гликозидов. Вторым фактором является малая навеска образца. Поэтому свободного кверцетина в аналитической навеске образца оказалось недостаточно для обнаружения.
Выводы
Таким образом, метод ВЭЖХ с УФ-детекцией может быть использован в фитохимическоми анализе травы альфредии поникшей для установления подлинности (идентификации и обнаружения фальсификации) по флавоноидному компоненту (рутину). Данный параметр может быть включен в комплекс нормативов, применяемых для идентификации травы альфредии и использоваться вкупе с прочими тестами.
Показателями, используемыми для и идентификации, являются:
1) время удерживания соединения на хроматограмме при заданных условиях = 14,5-14,6 мин;
2) соотношение интенсивности поглощения при длинах волн етах= 282 нм, ет1П= 262 нм; Параметры хроматографической системы:
а) система растворителей - 3,5% уксусная кислота - ацетонитрил;
б) температура системы - 35 °С, расход элюента - 100 мкл/мин;
в) программа градиента смены компонентов элюента:
Т, мин 0 3 3 25 25 33
% ацетонитрила 0 0 15 25 60 80
При этом, вероятно, нет необходимости в полном получасовом снятии хроматограммы, так как интересующие нас вещество-идентификатор удерживается в первые 15 мин.
Список литературы
1. Кувачева Н.В. Фармакогностическая характеристика альфредии поникшей (АпгесНа сегшда (Ь.) Сазз) и разработка на её основе лекарственного средства: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Пятигорск, 2010. 25 с.
14. Краснов Е.А., Блинникова А.А. Современные хроматографические методы (ГЖХ, ВЭЖХ) в фармацевтическом анализе: Учебное пособие. Томск, 2007. 152 с.
15. Семенистая Е.Н., Ларионов О.Г. Изучение состава и антиоксидантной активности растительных экстрактов методом ВЭЖХ с УФ- и амперометрическим детектированием // Химико-фармацевтический журнал. 2008. Т. 42, №9. С. 43-48.